The human long-term cell lines (LTC

The human long-term cell lines (LTC) (LN-18, LN-428, D247MG, LN-319, A172, U87MG, T98G, LN-308, LN-229) and human glioma-initiating cell lines (GIC) (T-325, T-269, ZH-161, S-24, ZH-305),17,18 LN-428, ZH-161 and ZH-305 cells with lentiviral cmet gene silencing,19 LN-229 cells with O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) overexpression,20 and LN-18 and LN-229 cells with acquired resistance to TMZ21 have been described. LTC were cultured in Dulbecco’s modi fied Eagle’s medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% glutamine (10 μL/mL) (Invitrogen, Basel, Switzerland). GIC were isolated after obtaining informed consent and approval of the local ethics committee from freshly resected tumors using the Papain Dissociation System (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ). Briefly, tumor tissue was minced and tissue was digested in DNase/Papain mixture (vial #2 and #3) for 30 min at 37 C. After incubation, the tissue was filteredtwice through a 70 μm mesh and washed with phosphatebuffered saline. Cells were centrifuged, the supernatant was removed and the pellet was separated into cells and membrane fragments by using a gradient consisting of sterile Earle’s Balanced Salt Solution/inhibitor solution mix (vial #1 and vial #3) and albumin inhibitor (vial #4). Cells were resuspended in phenol red-free complete Neurobasal Medium (NB) with B-27 supplement (20 μL/mL) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), L-glutamine (10 μL/mL), fibroblast growth factor-2 and epidermal growth factor (20 ng/mL each; Peprotech, Rocky Hill, PA) and penicillin/streptomycin (pen-strep, Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany) and cultured overnight. The next day medium was exchanged and cells were cultured in phenol red-free complete NB. All cells were sent for short tandem repeat analysis (DSMZ, Braunschweig, Germany) and are regularly tested for mycoplasma contamination.

結果 (繁體中文) 1:

人類長期細胞系（LTC）（LN-18，LN-428，D247MG，LN-319，A172，U87MG，T98G，LN-308，LN-229）和人神經膠質瘤起始細胞系（GIC）（ T-325，T-269，ZH-161，S-24，ZH-305），17,18 LN-428，ZH-161和ZH-305細胞用慢病毒的c-met基因沉默，19 LN-229細胞與O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（MGMT）的過表達，20和LN-18和LN-229細胞與到TMZ21獲得性抗性已被描述。LTC在Dulbecco氏MODI音響進行培養編補充有Eagle培養基10％胎牛血清和1％谷氨酰胺（10μL/ mL）中（Invitrogen公司，巴塞爾，瑞士）。GIC分別獲得知情同意和使用木瓜蛋白酶解離系統（沃辛頓生物化學品公司，雷克伍德，NJ）新鮮切除的腫瘤當地倫理委員會的批准後分離。簡要地Y，腫瘤組織切碎並組織在30分鐘的DNA酶/木瓜蛋白酶混合物（小瓶＃2和＃3），在37消化2 C。培養後，將組織網絡過濾的
兩次通過70微米網狀，並用鹽水phosphatebuffered洗滌。將細胞離心，將上清液除去，將沉澱物通過使用由無菌的Earle氏平衡鹽溶液/抑製劑溶液混合的梯度分離成細胞和膜碎片（小瓶＃1和小瓶＃3）和白蛋白抑製劑（小瓶＃4） 。將細胞重懸於苯酚細胞紅的完整的Neurobasal培養基（NB）與B-27補充物（20μL/ mL）的（賽默飛世科學的C，沃爾瑟姆，MA），L-谷氨酰胺（10μL/ mL）中，連接成纖維細胞生長因子-2和表皮生長因子（20ng / mL的每個; Peprotech公司，Rocky Hill的，PA）和青黴素/鏈黴素（青黴素 - 鏈黴素，Sigma-Aldrich公司/默克達姆施塔特，德國），並且培養過夜。第二天，更換培養基並將細胞在無酚紅的完整NB中培養。所有細胞的短串聯重複序列分析被送往（DSMZ，

結果 (繁體中文) 2:

人類長期細胞系（LTC）（LN-18、LN-428、D247MG、LN-319、A172、U87MG、T98G、LN-308、LN-229）和人膠質瘤啟動細胞系（GIC）（T-325、T-269、 ZH-161、S-24、ZH-305、17、18 LN-428、ZH-161和ZH-305細胞具有慢病毒cmet基因沉默，19個LN-229細胞具有O6-甲基苯甲酸酯DNA甲基轉移酶（MGMT）的表達，20和LN-18和LN-229細胞具有對TMZ21的獲得抗藥性。LTC在Dulbecco的ModifiedEagle的培養中培養，輔以10%胎兒小牛血清和1%谷氨醯胺（10μL/mL）（Invitrogen，瑞士巴塞爾）。GIC在獲得知情同意和經過當地倫理委員會批准後，使用帕帕因分離系統（沃辛頓生物化學公司，新澤西州萊克伍德）從剛剛切除的腫瘤中分離出來。簡單地說，腫瘤組織被切碎，組織在37°C下以DNase/Papain混合物（瓶#2和#3）消化30分鐘。孵育後，對組織進行過濾
兩次通過70μm的網，用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌。細胞離心，去除上清液，使用無菌Earle的平衡鹽溶液/抑制劑溶液混合（瓶#1和小瓶#3）和白蛋白抑制劑（瓶#4）的梯度將顆粒分離成細胞和膜片段。細胞被重新懸浮在無苯酚無紅的完整神經基礎介質（NB）與B-27補充劑（20μL/mL）（賽默費舍爾科學，沃爾瑟姆，MA），L-谷氨醯胺（10μL/mL），成纖維細胞生長因數-2和表皮生長因數（20納克/mL每個;佩普羅泰克，洛基山，PA）和青黴素/鏈黴素（筆鏈球菌，西格瑪-奧爾德里希/默克，達姆施塔特，德國）和養殖過夜。第二天，在無苯酚無紅全NB中交換培養細胞。所有細胞都送去進行短期串聯重複分析（DSMZ，德國布倫德國），並定期進行支原體污染測試。

結果 (繁體中文) 3:

人長期細胞系（LN-18、LN-428、D247MG、LN-319、A172、U87MG、T98G、LN-308、LN-229）和人腦膠質瘤始發細胞系（T-325、T-269、ZH-161、S-24、ZH-305）、17、18 LN-428、ZH-161和ZH-305，慢病毒cmet基因沉默，19 LN-229，O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（MGMT）高表達，20和已報導對TMZ21獲得性耐藥的LN-18和LN-229細胞。LTC在Dulbecco改良的Eagle培養基中培養，添加10%胎牛血清和1%穀氨醯胺（10μL/mL）（瑞士巴塞爾因維特羅根）。GIC是在獲得當地倫理委員會的知情同意和準予後，使用木瓜蛋白酶分離系統從新切除的腫瘤中分離出來的（沃辛頓生化公司，新澤西州萊克伍德）。Brie fly，將腫瘤組織切碎，並在37℃下用DNase/Papain混合物（第2和第3瓶）消化組織30分鐘。培養後，對組織進行過濾
兩次通過70μm的篩網，並用磷酸鹽緩衝鹽水清洗。用無菌厄爾平衡鹽溶液/抑制劑溶液混合物（第1瓶和第3瓶）和白蛋白抑制劑（第4瓶）組成的梯度離心細胞，去除上清液，將顆粒分離成細胞和膜碎片。細胞在無酚紅的完全神經基礎培養基（NB）中再懸浮，並補充B-27（20μL/mL）（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）、L-穀氨醯胺（10μL/mL）、成纖維細胞生長因數-2和表皮生長因數（各20 ng/mL；Peprotech，Rocky Hill，PA）和青黴素/鏈黴素（pen strep，Sigma Aldrich/Merck，Darmstadt，德國）並在一夜之間培養出來。第二天交換培養基，細胞在無酚紅完全NB中培養。所有細胞均進行短串聯重複分析（DSMZ，布倫瑞克，德國），並定期檢測支原體污染。