We examined a total of 51 specimens

We examined a total of 51 specimens from nine clutches using in situ hybridization. Of these, 22 composed a developmental series of embryos and hatchlings (hatched at 3.75 days) collected every 8 h from 2 to 4.67 days and then every 24 h until 6 days. We compared staining results from our probe with no-probe and sense probe controls for verification that our staining was not attributable to non-specific binding of BM purple. Embryos were preserved in MEMFA (100 mMMOPS buffer, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO4 and 3.7% formaldehyde) or 4% paraformaldehyde for 2–3 h,then dehydrated gradually into 100% methanol or 70% ethanol and stored and shipped frozen. Stored embryos were rehydrated in phosphate-buffered saline with 20% Tween 20 (six 10 min washes at room temperature,rocking) and prehybridized in hybridization buffer[50% formamide, 5× SSC (saline-sodium citrate buffer) pH 5, 50 μg/mL yeast tRNA, 50 μL/mL heparin,0.1% Tween 20 and 5% dextran sulfate] for 30 min rocking at room temperature, then 3–4 h at 65 °C. For hybridization, we incubated samples overnight at 65 °C in hybridization buffer with 0.75 ng/μL digoxigeninlabelled RNA probe. Samples were washed two times

結果 (繁體中文) 1:

我們使用原位雜交9離合器共51例檢查。這些中，22組成的串聯發育胚胎和幼禽（在3.75天陰影部分）的收集從2到4.67天每8小時，然後每24小時，直到6天。我們比較了探頭染色結果，沒有探頭和感探頭控制驗證，我們的染色是不是由於非特異性BM紫色的結合。胚胎在MEMFA被保存（100毫
MOPS緩衝液，2mM的EGTA，1mM的MgSO4和3.7％甲醛）或4％多聚甲醛2-3小時，
然後逐漸脫水到100％甲醇或70％的乙醇和儲存和運輸冷凍。存儲的胚胎在磷酸鹽緩衝鹽水中再水化，用20％吐溫20（6 10分鐘洗滌在室溫下，搖動），並在雜交緩衝液[50％甲酰胺，5×SSC（鹽水 - 檸檬酸鈉緩衝液）pH為5，50微克預雜交/ mL的酵母tRNA，50μL/ mL肝素，0.1％吐溫20和5％硫酸葡聚醣〕30分鐘搖動在室溫下，然後3-4小時，在65℃。對於雜交，我們在65下溫育樣品過夜℃下在雜交緩衝液中與0.75納克/μLdigoxigeninlabelled RNA探針。樣品洗滌兩次

結果 (繁體中文) 2:

我們使用原位雜交對 9 個離合器中的 51 個樣本進行了檢測。其中，22個胚胎和孵化系列（孵化3.75天）每8小時收集2至4.67天，然後每24小時至6天。我們將探針的染色結果與無探針和感應探針控制進行比較，以驗證我們的染色不是由於BM紫色的非特異性結合造成的。胚胎保存在MEMFA（100 mM）
MOPS緩衝液，2 mM EGTA，1 mM MgSO4和3.7%甲醛）或4%甲醛，2~3小時，
然後逐漸脫水成100%甲醇或70%乙醇，儲存並冷凍運輸。儲存的胚胎在磷酸鹽緩衝鹽水中再水化，20%補液20（室溫下6 10分鐘洗，搖動），在雜交緩衝液中預雜交[50%形式醯胺]， 5、 SSC （鹽酸鈉緩衝液） pH 5， 50 μg/mL 酵母 tRNA， 50 μL/mL 肝素， 0.1% 補膠 20 和 5% 硫酸鹽] 在室溫下搖動 30 分鐘，然後在 65 °C 下搖動 3-4 小時。對於雜交，我們在65°C的雜交緩衝液中用0.75納克/μL二角基因標記RNA探針在65°C下孵育樣品。樣品洗了兩次

結果 (繁體中文) 3:

我們用原位雜交科技檢測了來自9個離合器的51個標本。其中22個由2～4.67天每8h採集一次胚胎和幼體（3.75天孵化）組成發育系列，24～6天每24小時採集一次。我們比較了探針與非探針和傳感探針對照的染色結果，以驗證我們的染色不是由於BM紫色的非特异性結合所致。胚胎保存在MEMFA（100 mM
拖把緩衝液，2 mM EGTA，1 mM MgSO4和3.7%甲醛）或4%多聚甲醛2-3小時，
然後逐漸脫水成100%甲醇或70%乙醇，冷凍儲存和運輸。用20%吐溫20（6次10分鐘室溫洗滌，搖動）磷酸鹽緩衝液對保存的胚胎進行再水化，並在雜交緩衝液[50%甲醯胺，5×SSC（生理鹽水檸檬酸鈉緩衝液）pH 5，50μg/mL酵母tRNA，50μL/mL肝素，0.1%吐溫20和5%右旋糖酐硫酸鹽]中預混合，在室溫搖動30分鐘，然後在65℃下3-4小時。對於雜交，我們在65℃下用0.75 ng/μL地高辛標記的RNA探針在雜交緩衝液中孵育樣品過夜。樣品洗了兩次