Molecular identificationMycelia wer

Molecular identificationMycelia were scraped from colonies of six isolates (Phoma2, 3,4, 5, 6, 8) and used for DNA extraction. In addition, two isolates originating from blackleg-affected canola (Brassica napus)plants were also included; isolate L3 (Leptosphaeria biglobosa)is weakly virulent on canola cultivar Westar (Shoemaker &Brun, 2001) and isolate K135 (Leptosphaeria maculans ‘brassicae’) is highly virulent on Westar (Chen & Fernando, 2006)(isolates were provided by W. D. G. Fernando, University ofManitoba, Canada). The mycelium was transferred into a1.5 mL tube, kept on ice, and ground using a sterile pestle for20 s. Buffer (450 lL of 2 9 STE (0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0) and 50 lL 10% SDS) wasadded, mixed, and left at room temperature for 20 min. A mixture of 500 lL chloroform:isoamyl alcohol (24:1) was addedand incubated at room temperature for 20 min. The mixturewas centrifuged at 9300 g for 10 min and 400 lL of the supernatant was transferred to a new tube. One millilitre of 95%ethanol and 40 lL 3 M sodium acetate was added and the mixture was kept at
20 °C overnight or at
80 °C for 30 min.After centrifugation at 15 800 g for 15 min, the pellet waswashed with 70% ethanol, centrifuged at 15 800 g for 5 minand left at room temperature for 30 min. The DNA was redissolved in 20 lL elution buffer (EB; QIAGEN) or DNAse/RNAse-free water. For PCR, primers ITS2 (50-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-30) and ITS5 (50-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-30) were used to amplify the ITS1-5.8S-ITS2region (White et al., 1990). DNA (100 ng) and 0.5 lL 10 mMITS2 and ITS5 primers were added to the reaction buffer withTaq DNA polymerase (5 U; QIAGEN) in 25 lL total volume.The PCR conditions were 94 °C for 4 min; followed by 35cycles of 94 °C for 50 s, 58 °C for 1 min, 72 °C for 1 min; andextension at 72 °C for 7 min. For electrophoresis, 8 lL of PCRproduct was run on a 1% agarose gel. Fragments of 0.3–0.7 kbin size were collected using the MinElute gel extraction kit(QIAGEN) and sent for sequencing directly or the fragmentswere cloned into pUC19 (Invitrogen) or pGEM-T Easy (Promega) following the manufacturer’s protocols. Single white colonies were transferred into 3 mL Luria broth with 100 mg L
1ampicillin or 50 mg L
1 kanamycin and incubated at 37 °Covernight with vigorous shaking. The plasmid DNA wasextracted using the Wizard Plus Midiprep kit (Promega) anddigested with EcoRI to confirm the insertion. A sample (10 ng)of the plasmid with correct size insertions was sent to MacrogenInc. for sequencing using M13 forward and reverse primers forpUC19 constructs or T7 and SP6 primers for pGEM-T Easyconstructs.

結果 (繁體中文) 1:

分子鑑定
菌絲體從六個分離物（Phoma2，3，菌落刮下
4，5，6，8）和用於DNA提取。此外，兩個分離物從黑脛-受影響的低芥酸菜子始發（甘藍型油菜）
中還包括植物; 分離L3病（Leptosphaeria biglobosa）
是低芥酸菜子弱毒性栽培品種Westar（鞋匠＆
布倫，2001）和分離物K135（十字花科小球腔'甘藍'）是在種Westar（Chen和費爾南多，2006）高毒性
（分離物通過WDG費爾南多提供，大學
馬尼托巴省，加拿大）。菌絲體轉移到
1.5mL管中，保持在冰上，並用無菌研杵研磨
20秒。緩衝液（450為1L 2 9 STE（0.1M NaCl的，的10mM的Tris-HCl
（pH 8.0）中，1mM的EDTA（pH8.0）中，50為1L 10％SDS）中的溶液
加入，混合，並在室溫下放置20分鐘。加入500為1L氯仿的混合物：異戊醇（1 24）
，並在室溫下溫育20分鐘。將混合物
在9300克10分鐘，400為1L的上清液離心轉移至新管。95％的一毫升
溶液中加入乙醇和40為1L 3M乙酸鈉，將混合物保持在〜20℃下過夜或在？80℃下30分鐘。
在15800克15分鐘離心後，將沉澱物
用70％乙醇中，在15800克離心5分鐘
，並在室溫下放置30分鐘。或DNA酶/;的DNA在20為1L洗脫緩衝液（QIAGEN EB）再溶於
無RNA酶的水。對於PCR，引物ITS2（50
-GCTGCG
TTCTTCATCGATGC-30
）和ITS5（50
-GGAAGTAAAAGTCG
TAACAAGG-30
）被用來擴增該ITS1-5.8S-ITS2
區域（White等人，1990）。DNA（100毫微克）和0.5為1L的10mM
ITS2和ITS5引物加入到與反應緩衝液
的Taq DNA聚合酶;在25為1L總體積（5U QIAGEN）。
PCR條件是94℃4分鐘; 接著35
的94℃循環50秒，58℃1分鐘，72℃1分鐘; 和
在72℃下進行7分鐘的延伸。對於電泳，8為1L的PCR
產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。的0.3-0.7 kb的片段
使用的MinElute凝膠提取試劑盒收集在大小
（QIAGEN）和用於直接測序或片段發送
按照製造商的方案進行克隆到pUC19（Invitrogen）或的pGEM-T Easy中（Promega）中。單個白色菌落轉移至3mL Luria液體培養基含有100mg L 1
氨芐青黴素或50mg L 1卡那黴素，並溫育於37℃下
劇烈振盪培養過夜。物的質粒DNA
使用Wizard加中提試劑盒（Promega）提取並
用EcoRI消化，證實插入。將樣品（10毫微克）
用正確大小插入的質粒被送到Macrogen
公司使用M13正向為反向引物測序和
pUC19中構建體或T7和SP6引物進行的pGEM-T Easy中
的構建體。

結果 (繁體中文) 2:

分子識別
從6個分離物的菌落中刮出的菌絲（Phoma2，3，
4，5，6，8），用於DNA提取。此外，兩個分離物源自受黑腿影響的油菜籽（Brassica napus）
植物也包括在內;隔離L3（萊普托普海亞大洛博薩）
是弱毒性的油菜品種韋斯塔（鞋匠 *
布倫， 2001） 和隔離 K135 （萊普托普法裡亞麻將 '布拉西卡' ） 是高度毒的韋斯塔 （陳 & 費爾南多， 2006）
（隔離物由W.D.G.費爾南多大學提供
馬尼托巴，加拿大）。菌絲被轉移到一個
1.5 mL 管，保存在冰上，地面使用無菌蟲
20 s. 緩衝器 （450 lL 的 2 9 STE （0.1 M NaCl， 10 mM Tris-HCl
（pH 8.0）、1 mM EDTA （pH 8.0） 和 50 lL 10% SDS）
添加，混合，並在室溫下離開20分鐘。加入500 lL氯仿：等醇（24：1）的混合物
並在室溫下孵育20分鐘。混合物
在9300克離心10分鐘，400 lL的上清液被轉移到一個新的管。一毫升95%
加入乙醇和40 lL 3 M醋酸鈉，將混合物在20°C過夜或80°C保持30分鐘。
在 15 800 g 離心 15 分鐘後，顆粒
用70%乙醇洗滌，在15800克下離心5分鐘
並在室溫下離開30分鐘。DNA在20lL洗脫緩衝液中重新溶解（EB;QIAGEN） 或脫熱劑/
無RNA水。對於 PCR，引漆 ITS2 （50
-GCGCG
TTCTTATCGGC-30
） 和 ITS5 （50
-GGAAGTAAAGTCG
塔阿卡奧格-30
） 用於放大 ITS1-5.8S-ITS2
地區（懷特等人，1990年）。去氧核糖核酸（100納克）和0.5升L 10 mM
ITS2 和 ITS5 引引劑被添加到反應緩衝器中，
塔克DNA聚合酶（5U;QIAGEN）在25 lL總體積。
PCR條件為94°C4分鐘;後跟 35
94°C週期為50秒，58°C為1分鐘，72°C為1分鐘;和
在 72°C 下延長 7 分鐘。用於電泳，PCR 8 lL
產品在1%的甘蔗凝膠上運行。0.3~0.7 kb 的碎片
使用米埃魯特凝膠提取試劑盒收集尺寸
（QIAGEN），並直接發送進行測序或片段
按照製造商的協定被克隆成pUC19（Invitrogen）或pGEM-T易（Promega）。單白色菌落被轉移到3 mL Luria湯與100毫克L1
阿黴素或50毫克L1卡那黴素，在37°C孵育
一夜之間劇烈的搖晃。質粒DNA是
使用嚮導加米迪普套件 （Promega） 和
通過 EcoRI 進行消化，以確認插入。樣品 （10 ng）
具有正確尺寸插入的質粒被發送到宏根
使用 M13 正向和反向引注進行測序的 Inc.
pUC19 結構或 T7 和 SP6 引油，適用于 pGEM-T 輕鬆
構建。

結果 (繁體中文) 3:

分子鑒定
從6個分離株（Phoma2，3，
用於選取DNA。另外，兩個來自黑腿菜籽油的分離物（甘藍型油菜）
還包括植物；分離株L3（大葉鉤端螺旋體）
對油菜品種Westar（鞋匠）弱毒力&
Brun，2001）和分離株K135（黃斑鉤端螺旋體‘芸苔科’）對Westar的毒力很强（Chen&Fernando，2006）
（分離株由美國費爾南多大學的W.D.G.Fernando提供）
加拿大馬尼托巴）。菌絲體被轉移到
1.5毫升試管，置於冰上，用無菌杵研磨
20 s.緩衝液（450 lL 2 9 STE（0.1 M NaCl，10 mM Tris HCl
（pH 8.0）、1 mM EDTA（pH 8.0）和50 lL 10%十二烷基硫酸鈉
添加，混合，並在室溫下放置20分鐘。添加500毫升氯仿：异戊醇（24:1）的混合物
在室溫下孵育20分鐘
以9300g離心10min，將400ll上清液移入新試管。一毫升95%
加入乙醇和40毫升3米醋酸鈉，並將混合物在20℃下過夜或在80℃下保持30分鐘。
在15 800 g離心15分鐘後，顆粒
用70%乙醇洗滌，15 800 g離心5分鐘
在室溫下放置30分鐘，在20ll洗脫液（EB；QIAGEN）或DNAse中重新溶解DNA/
不含核糖核酸酶的水。對於PCR，引子ITS2（50
-GCTGCG公司
TTCTTCGATGC-30型
）以及它的5（50
-GGAAGTAAGTCG公司
塔卡格-30
）用於擴增ITS1-5.8S-ITS2
區域（White等人，1990年）。DNA（100 ng）和0.5 lL 10 mM
在反應緩衝液中加入ITS2和ITS5引子
Taq DNA聚合酶（5u；QIAGEN），總體積25ll。
PCR條件為94°C，持續4分鐘；然後是35
94°C迴圈50秒，58°C迴圈1分鐘，72°C迴圈1分鐘；以及
在72°C下延長7分鐘。用於電泳，8 lL PCR
產品在1%瓊脂糖凝膠上運行。0.3-0.7kb的片段
使用Minelote凝膠選取試劑盒收集尺寸
（橋根）直接或片段測序
按照製造商的協定尅隆到pUC19（Invitrogen）或pGEM-T Easy（Promega）中。將單個白色菌落轉移到3ml Luria肉湯中，加入100mg L1
氨苄西林或50 mg L1卡那黴素並在37℃下培養
一夜之間劇烈搖晃。質粒DNA是
使用Wizard Plus Midiprep工具包（Promega）選取
用EcoRI消化以確認插入。樣品（10 ng）
有正確大小插入的質粒被送到Macrogen
使用M13正向和反向引子進行測序
pUC19結構或T7和SP6引子用於pGEM-T Easy
構造。