Enzymatic assayThe enzymatic monoph

Enzymatic assay
The enzymatic monophenolase activity was determined by
monitoring the change in UV absorbance at 305 nm (dopachrome
formation (Rodríguez-López et al., 1992)) (Fig. 1D). When measur￾ing the activity of ‘‘active forms’’ of TYR, 10 lL of enzyme solution
were added to 1 mL reaction mixture containing 35 mM potassium
phosphate buffer, pH 6.5, and 0.033 mM tyrosine as substrate. One
unit [U] monophenolase activity was defined as the increase of
1 mAU per minute at a path length of 1 cm at 25 C. When measur￾ing activity of the latent forms of the enzyme, the buffer system
(for better solubility of SDS) was changed to 10 mM sodium phos￾phate buffer, pH 6.5, containing 1.3 mM SDS. Latency was calcu￾lated using the following equation.
latency ½% ¼ 1 activityðSDSÞ½U mL1

activityðþSDSÞ½U mL1

!  100
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
Analyses by denaturating SDS–PAGE under reducing (2-
mercaptoethanol) and non-reducing conditions (data for non￾reducing not shown), respectively, were established as described
elsewhere using a total polyacrylamide concentrations of 12% (Lae￾mmli, 1970). Reduced samples were reacted with 3-iodopropiona￾mide for alkylation of Cysteines. Sample load onto the gel was
about 2 lg. Gels were stained with Coomassie Brilliant Blue. The tar￾get protein (L-TYR, 62 kDa) as well as the faint bands (15 kDa) in
the A-TYR lane were cut out and used for protein identification.
Imaging of the gels was done with the Gel Doc™ XR of Bio Rad
(Fig. 2).
Protein identification and sequence analysis
The gel piece covering the single bands obtained by denaturing
SDS–PAGE (reduced and non-reduced) and containing approxi￾mately 2 lg of protein were used. Proteomic analyses were carried
out after tryptic digestion by use of nanoLC–ESI-MS/MS with a
LTQ-Orbitrap mass spectrometer. In addition samples were also
measured by Proteom Factory AG (www.proteomefactory.com).
Protein identification was based on the Mascot Search software
and the NCBInr 110509 database as well as Peaks Studio 6.0 search
software and UniProt/SwissProt database, respectively. Peptide
mass tolerance was 5 ppm and fragment mass tolerance 0.5 Da.
Variable modifications allowed were oxidation of methionine
and, in the cases of reduced samples, also propionamidation of cys￾teines. For detailed information about the used method- and
search software-parameters see the Supporting information.
Determination of the molecular mass
The mass spectrum of the intact protein was measured using a
nanoESI-QTOF mass spectrometer (maXis 4G UHR-TOF, Bruker)
with a mass resolving power of about 40,000 in the used m/z –
range and a mass accuracy of better than 5 ppm (confirmed by
standard proteins). Prior to MS measurements, the purified L-TYR
solution was ultra filtrated by centrifugation (10,000 rpm) and
the buffer system was changed to 5 mM ammonium acetate pH
5.5 in order to reduce salt concentration to a minimum. Afterward
acetonitrile (ACN, MS grade) and formic acid were added to a final
concentration of 25% (v/v) ACN and 0.05% (v/v) formic acid. Sample
introduction (1 lL sample volume contains about 0.3 lg of protein,
taken from 20 lL total sample volume) was done by using a nano￾spray robotic device (Nanomate, Advion Biosciences).
Comp

結果 (中文) 1:

酶法测定单酚酶活性测定在 305 紫外吸光度变化监测毫微米 （多巴色素（罗德里格斯 · 洛佩斯 et al.，1992年） 形成） (图 1)。当测量 ing 的 TYR，10 '主动形式 ' 活动的酶溶液被添加到 1 毫升反应混合物含 35 毫米钾磷酸盐缓冲，ph 值 6.5 和 0.033 毫米酪氨酸为底物。一个单位 [U] 单酚活动被定义为的增加1 茂每分钟在 1 厘米在 25 C.路径长度当测量 ing 活性的酶，缓冲系统的潜在形式（为更好的溶解性 SDS） 改为 10 毫米钠磷磷酸缓冲，pH 6.5，含 1.3 毫米 SDS。延迟是延续使用以下公式计算。延迟 ½ %¼ 1 activityðSDSÞ½U mL1activityðþSDSÞ½U mL1!100分析聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)按下减少 （2-SDS-PAGE 变性分析巯基乙醇）、 非还原条件 （非不减少所示的数据），分别建立了所述在其他地方用总聚丙烯酰胺浓度的 12%(Lae mmli，1970年)。减少的样品与 3 iodopropiona 迟迟不能为半胱氨酸的烷基化反应。到这种凝胶样品负载是约 2 lg。 凝胶与考马斯亮蓝染色。焦油得到蛋白 （L-酪氨酸、 62 kDa） 并且微弱乐队 (15 kDa)A TYR 车道被剪出，用于蛋白质鉴定。凝胶成像进行生物 rad 凝胶 Doc™ XR(图 2)。蛋白的鉴定及序列分析凝胶片覆盖所得变性的单一乐队采用 SDS-PAGE （减少和非减少） 和含有近似填装 2 lg 的蛋白质。进行了蛋白质组学分析使用的 nanoLC — — ESI/MS 与胰蛋白酶消化后出及时 Orbitrap 质谱计。此外样品还了测定蛋白质工厂 AG (www.proteomefactory.com)。蛋白质鉴定基于吉祥物搜索软件和 NCBInr 110509 数据库，以及峰 Studio 6.0 搜索数据库软件和 UniProt/SwissProt，分别。多肽大规模的容忍是 5 ppm 和片段质量允差 0.5 大。允许的变量修改了蛋氨酸氧化以及在减少样品，也 propionamidation 的半胱氨酸 teines 的情况下。有关使用方法的详细信息和搜索软件参数请参见支持信息。分子质量的测定完整的蛋白质的质谱测定nanoESI QTOF 质谱仪 (maXis 4 G UHR TOF、 布鲁克)与质量分辨率约 40 000 在使用 m/z — —范围和质量精度优于 5 ppm （经证实标准蛋白质）。事先对 MS 测量，提纯 L-酪氨酸解决办法是超过滤离心 （10000 转） 和缓冲系统改为 5 毫米铵醋酸 ph 值为了减少到最低限度的盐浓度 5.5。后来乙腈 （ACN，MS 级） 和甲酸被添加到决赛浓度为 25%(v/v) ACN 和 0.05%(v/v) 蚁酸。示例简介 （1 lL 样品卷载有关于 0.3 lg 的蛋白质，取自 20 lL 总样本量） 通过使用纳米喷雾机器人装置 （Nanomate，Advion 生物科学）。Comp

結果 (中文) 3:

酶法测定由单酚酶活性的酶在305 nm的紫外吸光度的变化监测（多巴色素形成（设计íguez-lóóet al.，1992））（图1d）。当测量￾ING的活动“活动形式的酪氨酸，酶解会10被添加到1毫升的反应混合物，含有35毫米的钾磷酸盐缓冲液，pH值为6.5，和0.033毫米酪氨酸为底物。一[美]单酚酶活性单位定义为增加1茅每分钟1厘米的路径长度在25℃时测量￾活动的酶的潜在形式，缓冲系统（更好的溶解度SDS）改为10毫米￾磷酸磷酸钠缓冲液，pH值6.5，含1.3 mM SDS。潜伏期￾相关使用下面的公式计算。潜伏期为1½¼活动ðSDSÞ½U 1活动ðþSDSÞ½U 1！一百分析聚丙烯酰胺凝胶电泳（页）分析–变性SDS页下降低（2—巯基乙醇）和非还原条件下（非￾减少未显示数据），分别建立了描述在其他地方使用总聚丙烯酰胺浓度的12%（莱城￾mmli，1970）。降低样品的3-iodopropiona￾酰胺烷基化的半胱氨酸反应。到凝胶上的样品负载2 LG。凝胶用考马斯亮蓝染色。焦油￾得到蛋白（酪氨酸，62 kDa）以及微弱的条带（15 kDa）在的a-tyr车道被切断，用于蛋白质的鉴定。凝胶的成像采用Gel Doc XR的™Bio-Rad（图2）。蛋白质鉴定与序列分析由变性的获得的单条带的凝胶片SDS–页（还原和非还原）和含有近似￾用约2 LG蛋白。进行了蛋白质组学分析由一个纳–ESI-MS/MS用胰蛋白酶消化后LTQ Orbitrap质谱仪。此外样品也用蛋白质组学公司（www.proteomefactory。com）。蛋白质识别是基于吉祥物的搜索软件110509、NCBInr数据库以及峰工作室6搜索软件和UniProt / SwissProt数据库，分别。肽质量公差为5 ppm和碎片质量公差0.5大。可变的修改允许的蛋氨酸的氧化而且，在减少的情况下的样品，也propionamidation Cys￾teines。有关所使用的方法的详细信息-和搜索软件参数见支持信息。分子质量的测定使用一个完整的蛋白质的质谱测定微ESI QTOF质谱仪（Maxis 4g uhr-tof，布鲁克）与质量分辨能力约为40000，在使用的M / Z -范围和质量精度优于5 ppm（经标准蛋白）。MS测量之前，纯化的酪氨酸解决方案是超过滤，离心（10000转）和缓冲系统被改变为5毫米的醋酸铵pH值5.5，以减少盐浓度到最低。后来乙腈（ACN，毫秒级）和甲酸添加到最后浓度为25%（v/v）乙腈和0.05%（v/v）甲酸。样品简介（1将样品体积大约包含0.3的LG蛋白，从20将总样本量）是利用纳米￾喷雾装置（纳米机器人完成，advion Biosciences）。COMP