Synthesis of 5PP-InsP5. To synthesi

Synthesis of 5PP-InsP5. To synthesize 5PP-InsP5 chemoenzymatically, we recombinantly expressed IP6KA, an InsP6kinase from the parasitic amoeba E. histolytica.28,29 Theadvantage of this enzyme, compared to the commonly usedhuman IP6K1, is its fast reaction kinetics, good stability, andhigh expression yield (∼100 mg of protein/L of Escherichia coliculture). The InsP6 substrate can be obtained commercially(Calbiochem) or prepared from myo-inositol using astraightforward two-step literature procedure.30,31 Next, thereaction conditions (pH, time, and enzyme and Mg2+concentrations) were optimized using 13C-labeled InsP6([13C6]InsP6) as a substrate to monitor PP-InsP kinase activityin vitro by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.32Full conversion to the 5PP-InsP5 product was achieved within30 min, applying 0.3 μM IP6KA in combination with an ATPrecycling system (pCr and CrK) (Figure 2a and Figure S1).32Determining the right balance among phosphate-containingspecies, Mg2+ ions, and pH proved to be an integralconsideration to prevent precipitation of InsP6 during thereaction.With the optimized conditions (0.3 μM IP6KA, 2 mM ATP,7 mM MgCl2, and 250 μM InsP6), we scaled up the reaction to350 mg of InsP6 starting material and a total reaction volumeof 2 L. To accurately control the reaction time, it was crucial topreincubate the reaction mixture at 37 °C before the additionof IP6KA and to quench the solution by cooling to 4 °C within3−5 min using a −78 °C dry ice bath. For large scalepurification, the proteins were removed by passing the solutionFigure 1. Current synthetic strategies for the preparation of distinct PP-InsPs from commercially available starting materials. Organic multistepsyntheses (left) produce PP-InsPs in high purity from myo-inositol with low overall yields due to several challenging steps. Enzymatic syntheses(right) convert InsP6 in one or two steps into PP-InsPs. To chemoenzymatically obtain 5PP-InsP5 and 1PP-InsP5, IP6K1 and Vip1 have beenapplied, respectively.Figure 2. Biochemical synthesis and purification of 5PP-InsP5. (a)Optimized conditions for the conversion of InsP6 by IP6KA.Conditions: 250 μM InsP6, 2 mM ATP, 7 mM MgCl2, 5 mMcreatine phosphate (pCr), 1 U/mL creatine kinase (CrK), 0.3 μMIP6KA, 50 mM NaCl, and 20 mM MES (pH 6.4). (b) Separation of5PP-InsP5 from the reaction components. Enzymes were removed bya C18 plug, and the product precipitated as a PP-InsP−Mg complexby addition of excess MgCl2. Mg2+ ions were subsequently exchangedby solid phase chelation in an ammonium carbonate buffer, andlyophilization afforded the product as the ammonium salt. (c) 31PNMR spectrum of purified 5PP-InsP5

結果 (繁體中文) 1:

5PP-InsP5的合成。合成5PP-InsP5 chemoenzymatically，我們重組表達IP6KA，一個InsP6
從寄生變形蟲溶組織內阿米巴激酶。
28,29的
這種酶的優點，相對於通常使用的
人類IP6K1，是其快速反應動力學，穩定性好，並
高表達產量（〜100 mg蛋白質/ L大腸桿菌的
培養物）。所述InsP6基底可以商購獲得
（Calbiochem公司），或者從製備肌醇使用
簡單的兩步文獻procedure.30,31接著，將
反應條件（pH，時間，以及酶和Mg 2+
的濃度）使用優化的13C標記InsP6
（[13C6] InsP6）作為底物來監測PP-INSP激酶活性
在體外通過核磁共振（NMR）spectroscopy.32
完全轉化為5PP-InsP5產物內實現
30分鐘，施加0.3μMIP6KA在與ATP
回收系統（PCR和CRK）（圖2a和圖S1）。 32
確定含磷酸鹽之間的平衡
物質，Mg 2+離子和pH被證明是一個整體
考慮，以防止期間InsP6的沉澱
反應。
用優化條件下（0.3μMIP6KA，2毫摩爾ATP，
7mM的MgCl 2和250μM的InsP6），我們按比例放大反應
350毫克InsP6原料和總反應體積
的2 L.為了準確地控制反應時間，這是至關重要的
預溫育，在37℃的反應混合物中添加前
IP6KA的並通過冷卻至4℃的範圍內以淬滅溶液
使用-78℃乾冰浴3-5分鐘。對於大規模
純化，將蛋白質通過使溶液中取出
圖1當前的合成策略用於從市售的起始原料製備不同PP-InsPs的。有機多步
合成（左）生產聚丙烯InsPs在從肌醇具有低總收率的高純度由於幾個挑戰性的步驟。酶促合成
（右）轉換InsP6在一個或兩個步驟為PP-InsPs。到chemoenzymatically獲得5PP-InsP5和1PP-InsP5，IP6K1和VIP1已經
分別施加。
圖2.生化合成和5PP-InsP5的純化。（a）中
的優化條件InsP6的由IP6KA轉換。
條件：250μMInsP6，2毫摩爾ATP，7mM的MgCl 2的，5mM的
磷酸肌酸（PCR），1U / mL的肌酸激酶（CRK），0.3μM
IP6KA，50mM的NaCl和20mM的MES（pH為6.4）。（b）的分離
從反應組分5PP-InsP5。酶通過去除
一個C18插頭，產物沉澱為PP-INSP-Mg配合物
通過添加過量的MgCl 2。Mg 2+離子隨後交換
通過固相螯合在碳酸銨緩衝液中，並
冷凍乾燥得到產物，為銨鹽。（C）31 P
NMR純化5PP-InsP5的光譜

結果 (繁體中文) 2:

5PP-InsP5的合成。為了合成5PP-InsP5化學，我們重組地表達IP6KA，一個InsP6
寄生阿米巴E.組織溶酶的激酶。
28，29
這種酶的優點，與常用的
人類IP6K1，是其快速反應動力學，良好的穩定性，和
高表達產量（100毫克大腸桿菌蛋白/L
文化）。InsP6 基板可進行商業獲取
（鈣化）或從肌醇製備使用
直接的兩步文獻程式.30，31 下一步，
反應條件（pH、時間和酶和Mg2+
濃度）使用 13C 標記的 InsP6 進行了優化
（[13C6]InsP6）作為基板監測PP-InsP激酶活性
在體外通過核磁共振（NMR）光譜。
完全轉換為 5PP-InsP5 產品是在
30 分鐘，將 0.3 μM IP6KA 與 ATP 結合使用
回收系統（pCr 和 CrK）（圖 2a 和圖 S1）。
確定含磷酸鹽之間的適當平衡
物種，Mg2+ 離子和pH被證明是一個整體
考慮防止InsP6在
反應。
優化條件（0.3 μM IP6KA，2 mM ATP，
7 mM MgCl2 和 250 μM InsP6），我們放大了反應
350毫克InsP6起始材料和總反應量
2 L.為了準確控制反應時間，必須
在加入前在37°C下預育反應混合物
IP6KA，並通過冷卻至4°C來淬火溶液。
使用 +78 °C 乾冰浴 3⁄5 分鐘。用於大規模
純化，通過溶液去除蛋白質
圖 1.目前從市售的起始材料中製備不同PP-InsPs的合成策略。有機多步
合成器（左）產生高純度的PP-InsPs，由於幾個具有挑戰性的步驟，整體產量較低。酶合成
（右）在一兩個步驟中將 InsP6 轉換為 PP-InsP。為了化學上獲得5PP-InsP5和1PP-InsP5，IP6K1和Vip1已經
分別應用。
圖 2.5PP-InsP5的生物化學合成和純化。（a）
IP6KA 轉換 InsP6 的優化條件。
條件： 250 μM InsP6， 2 mM ATP， 7 mM MgCl2， 5 mM
磷酸肌酸（pCr），1 U/mL肌酸激酶（CrK），0.3 μM
IP6KA、50 mM NaCl 和 20 mM MES（pH 6.4）。（b） 分離
5PP-InsP5 來自反應成分。酶被移除
C18 插頭，產品沉澱為 PP-InsP_Mg 複合物
通過添加過量的MgCl2.Mg2+離子隨後被交換
通過碳酸銨緩衝液中的固相結合，以及
凍幹使產品成為銨鹽。（c） 31P
純化 5PP-InsP5 的 NMR 光譜

結果 (繁體中文) 3:

5PP-InsP5的合成。為了化學酶法合成5PP-InsP5，我們重組表達了IP6KA，一個InsP6
溶組織阿米巴的激酶。
28,29年
與常用的
人體IP6K1，反應動力學快，穩定性好，且
高表達率（∼100 mg蛋白質/L大腸桿菌
文化）。InsP6基板可以商業化地獲得
（鈣生化合物）或用肌醇製備
直接的兩步文獻程式。30,31下一步
反應條件（pH、時間、酶和Mg2+
使用13C標記的InsP6優化濃度
（[13C6]InsP6）作為監測PP-InsP激酶活性的底物
體外核磁共振波譜法。32
完全轉化為5PP-InsP5產品在
30分鐘，應用0.3μM IP6KA和ATP
回收系統（pCr和CrK）（圖2a和圖S1）。32
確定含磷量之間的正確平衡
物種、Mg2+離子和pH被證明是一個整體
防止InsP6在
反應。
在優化的條件下（0.3μM IP6KA，2 mM ATP，
我們將反應放大到
350 mg InsP6起始資料和總反應體積
為了精確控制反應時間
添加前，在37°C下預培養反應混合物
IP6KA，並通過冷卻至4°C在
使用-78°C乾冰浴3-5分鐘。大規模
純化，蛋白質通過溶液被去除
圖1。從市售起始資料製備不同PP-InsPs的當前合成策略。有機多級
合成（左）以肌醇為原料生產高純度PP-InsPs，由於幾個具有挑戰性的步驟，總收率較低。酶法合成
（右）一步或兩步將InsP6轉換為PP InsPs。為了化學酶法獲得5PP-InsP5和1PP-InsP5，IP6K1和Vip1
分別適用。
圖2。5PP-InsP5的生化合成與純化。（一）
IP6KA轉化InsP6的優化條件。
條件：250μM InsP6，2 mM ATP，7 mM MgCl2，5 mM
磷酸肌酸（pCr），1 U/mL肌酸激酶（CrK），0.3μM
IP6KA、50 mM NaCl和20 mM MES（pH 6.4）。（b）分離
來自反應組分的5PP-InsP5。酶被
C18塞，產物沉澱為PP-InsP-Mg絡合物
加入過量的氯化鎂。Mg2+離子隨後被交換
在碳酸銨緩衝液中進行固相螯合，以及
冷凍乾燥得到的產品為銨鹽。（c）31便士
純化5PP-InsP5的核磁共振波譜