The 8 nm regular stepping of kinesi

The 8 nm regular stepping of kinesin differs substantially from the cytoplasmic dynein motor, which takes a wide range of forward (4–24 nm), backward (20%), as well as sideways steps (Reck-Peterson et al., 2006 and Gennerich et al., 2007). However, by extending the kinesin neck linker, we were able to produce a motor with a stepping behavior that is more similar to dynein than to WT kinesin. This result reveals that the regular pattern of stepping can be modulated by varying the length and flexibility of the elements interconnecting the two motor domains. In some cases, it may be advantageous to design highly efficient and regular motors (kinesin and myosin V), whereas in other cases, reducing motor efficiency but increasing its ability to move around the track (dynein and myosin VI) may help to avoid obstacles (Dixit et al., 2008). It will be interesting to explore how modulating a motor's stepping behavior affects its ability to execute transport functions in living cells.

Experimental Procedures

Single Molecule Fluorescence Motility Assays

The construct design is described in the Supplemental Experimental Procedures.

For single-molecule motility assays, sea urchin axonemes were immobilized on a glass surface, and 200 pM kinesin motor was then perfused into the chamber in motility buffer (12 mM PIPES [pH 6.8], 1 mM MgCl2, 2 mM EGTA, and 1 mg/ml casein) containing 2 mM DTT, 2% glucose, and 3 μl “gloxy” to remove free oxygen in solution (Yildiz et al., 2003). Speed and run length measurements were performed with GFP-labeled motors at 1 mM ATP using total internal reflection fluorescence microscopy, as described elsewhere (Reck-Peterson et al., 2006).

For high-precision fluorescent tracking, a unique reactive cysteine was introduced in the catalytic core (E215C), dialyzed motors were labeled with biotin-maleimide (EZ-link PEO2, Pierce) at 0.5 biotins per head (2 hr, 4°C), the reaction was quenched with 2 mM DTT, and excess of biotin was removed through microtubule affinity purification. Microtubule-bound, biotinylated kinesin motors were incubated with 400 nM streptavidin-coated quantum dots (655 nm, Invitrogen) for 5 min within the flow chamber in the absence of ATP (reaction was performed on microtubule-bound kinesin to avoid aggregation from multivalent quantum dots). The sample was washed with imaging buffer containing 140 mM 2-mercaptoethanol. Motor velocity was kept in the range of 10–15 nm/s by adding different concentrations of ATP for each construct (see Figure 3 legend). At this speed, we could minimize scoring two successive steps as one “large step,” since the motor's average dwell time (950 ms) was long, compared with the temporal resolution (70 ms). Our step detection program scores a dwell period consisting of three data points (210 ms). At this time resolution, we estimate that only 2% of our scored steps will be due to the rapid succession of two steps. We also compared stepping of different constructs at similar average dwell times to minimize artifacts (such as selectively scoring two steps as one large step for one construct).

To crosslink the C termini of the neck-linker region, a cysteine was introduced to position 337 of the 13P cysteine-free mutant (Cys-13P). Purified Cys-13P (2 μM) were treated with 2 mM TCEP for 30 min and then were passed through a desalting column (NAP5, GE Healthcare), and a bifunctional maleimide crosslinker (BMOE, Pierce) was added at an equimolar ratio to motor for 4 hr in 80 mM Pipes (pH 7.0), 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, and 1 mM EGTA at 4°C. The remaining crosslinker was quenched with 10 mM DTT for 30 min.

結果 (中文) 1:

8纳米定期步进驱动蛋白有很大的不同，这需要广泛的前锋（4-24纳米），向后（20％），以及侧身步骤（RECK彼得森等人，2006年和胞质动力蛋白马达gennerich等，2007）。然而，通过扩展动蛋白颈连接器，我们能够生产电机与步进行为更类似于比重量驱动蛋白和dynein。这一结果表明，通过改变元素互连的两个电机域的长度和柔性，可调制的步进规律。在某些情况下，它可能是有利的设计高效和定期的电机（驱动蛋白和肌球蛋白v），而在另一些情况下，电机效率降低，但增加其周围的轨道（动力蛋白和肌球蛋白VI）的移动能力，可以帮助避开障碍物（Dixit等人，2008）。这将是有趣的探索如何调节电机的步进行为影响其执行能力传输功能，在活细胞。
实验步骤

单分子荧光动力分析

中描述的构建体的设计的补充的实验程序。

单分子动力检测，海胆axonemes的被固定在玻璃表面上，驱动蛋白马达200时，然后灌注到腔室在蠕动缓冲液中（12毫米管[ph值6.8]，1毫米氯化镁，EGTA2毫米，含1毫克/毫升的酪蛋白）的2毫米DTT，2％葡萄糖，和3微升的“gloxy”，以除去游离在溶液中的氧气（伊迪兹等人，2003）。 GFP标记的电机进行速度和运行长度测量在1毫米ATP利用全内反射荧光显微镜，其他地方所描述（RECK彼得森等人，2006）。
高精度荧光跟踪，独特的活性半胱氨酸被引入的催化核心（e215c），透析过的电机被标记的生物素 - 马来酰亚胺（易通PEO2，穿孔），在每人0.5生物素（2小时，4℃），将反应物骤冷，2毫米DTT，并除去过量的生物素亲和纯化通过微管。微管结合，培养与生物素化的驱动蛋白马达400纳米链霉亲和素包被的量子点（655纳米，Invitrogen公司）在没有三磷酸腺苷（微管结合的驱动蛋白进行反应，以避免聚合由多价量子点）的5分钟内的流动室。 140毫米2 - 巯基乙醇与成像缓冲液洗涤样品。电机速度保持在10-15 nm / s时的范围内，通过添加不同浓度的ATP为每个结构（参见图3传说）。以这样的速度，我们可以减少打进两个连续的步骤，一个“庞大的步骤，”由于电机的平均停留时间（950毫秒）很长，时间分辨率（70毫秒）相比。步数检测程序分数中的停留期间，组成的三个数据点（210毫秒）。在这个时间分辨率，我们估计我们打进步骤，只有2％是由于快速连续两个步骤。我们踩着不同的结构也比较相似的平均停留时间，以减少工件（如选择性地打进两个步骤为一体的大型一步一个结构）。

交联C末端的颈部连接区域，半胱氨酸引入位置337的13P半胱氨酸突变体（CYS-13P）。加入纯化的治疗13p的半胱氨酸（2微米）与2毫米TCEP 30分钟，然后分别通过脱盐柱（NAP5，GE医疗集团），和双官能的马来酰亚胺交联剂（bmoe，穿孔）电机等摩尔比在80毫米的管（pH值7.0），100mM NaCl的氯化镁，1毫米，1毫米EGTA于-4℃搅拌4小时。剩余的交联剂骤冷30分钟与10毫米DTT。

結果 (中文) 2:

8 nm定期加强蛋白从胞质动力蛋白电机有很大的不同，采用了宽范围（4–24 nm），后（20%），以及横向的步骤（RECK彼得森等人。，2006，gennerich等人。，2007）。然而，通过扩展的驱动蛋白的颈部连接，我们可以生产电机与步进的行为是比小波更类似动力蛋白驱动蛋白。这一结果表明，步进的规律可以通过不同的元素相互连接的两个马达域的长度和柔性调制。在某些情况下，它可能是有利的设计高效的和定期的电机（驱动蛋白，肌球蛋白V），而在其他情况下，减速电机效率，增加其左右移动的跟踪能力（动力蛋白和肌球蛋白VI）可能有助于避免障碍（Dixit等人。，2008）。这将是如何调节电机的步进特性影响了其在活细胞的功能执行运输能力很有趣。

实验程序

单分子荧光活力测定

建筑设计是在补充实验程序的描述。

单分子运动检测，海胆axonemes被固定在玻璃表面上，和200 PM马达进行灌注到动力缓冲室（12毫米管[ 6.8 ]的pH值，1毫米氯化镁，2毫米EGTA，和1毫克/毫升酪蛋白）含有2 mM DTT，2%葡萄糖，3μL“银河”去除溶液中的游离氧（Yildiz等人。，2003）。GFP标记的马达在1毫米ATP利用全内反射荧光显微镜进行速度和运行长度的测量，如其他地方（RECK彼得森等人。，2006）。

荧光跟踪精度，一个独特的反应半胱氨酸的催化核心（e215c）介绍，透析电机用生物素标记的马来酰亚胺（EZ链接PHO2，皮尔斯）0.5生物素每头（2小时，4°C），反应被2毫米DTT，和过量的生物素是通过微管的亲和纯化去除。微管结合，生物素化的驱动蛋白马达与400 nm的链霉抗生物素涂覆的量子点（655 nm孵育，Invitrogen公司）5分钟内没有ATP的流室（反应对微管结合蛋白进行避免多价量子点聚集）。样品用缓冲液含有140 mM的巯基乙醇洗成像。电机速度保持在10–15 nm / s的范围内，加入不同浓度的ATP的每个构造（见图3的传说）。以这样的速度，我们可以最大限度地减少评分的两个连续的步骤作为一个“大的一步，”由于电机的平均停留时间（950毫秒）长，与时间分辨率相比（70毫秒）。一步一步检测程序的分数驻留组成的三个数据点周期（210毫秒）。在这个时间分辨率，我们估计，只有2%的得分的步骤将是由于两个步骤的快速演替。我们还比较了步进不同的结构在相似的平均停留时间，减少工件（如选择性评分两步一大步建造）。

交联的颈部连接区域的C末端，半胱氨酸引入的半胱氨酸突变体（337者自由位置cys-13p）。纯化的cys-13p（2μM）与2毫米tcep处理30分钟，然后通过脱盐柱（nap5，GE医疗），和双马来酰亚胺交联剂（bmoe，皮尔斯）在等摩尔比电机4小时80毫米管增加（pH值7），氯化钠100毫米，1毫米氯化镁，和1毫米EGTA在4°C.剩余的交联剂被10毫米DTT 30分钟。

結果 (中文) 3:

8 毫微米定期的步进驱动蛋白，极大地不同于细胞质 dynein 电机，采用范围广泛的转发 （4 到 24 nm）、 落后 (20%)，以及侧身步骤 (Reck 彼得森 et al.，2006年和根内里希 et al.，2007年)。然而，通过扩展驱动蛋白的脖子链接器，大家都能够产生一个马达与单步执行的行为更类似于比到 WT 驱动蛋白 dynein。这一结果表明不同的长度和互连电机的两个域的元素的灵活性可以调制步进的常规模式。在某些情况下，可能是有利的设计高度有效和定期电机 （驱动蛋白和肌球蛋白 V），而在其他情况下，减少电动机的效率，但增加移动的轨迹 (dynein 和肌球蛋白 VI) 其功能可能有助于避免发生障碍 （迪克西特 et，2008年）。这一定很有趣，探讨如何调节电机步进行为影响了它的能力来执行运输职能中生活细胞。

实验程序

单分子荧光动力测定

构造设计描述的补充实验程序。

为单分子动力化验，海胆 axonemes 被固定化在玻璃的表面，和 200 pM 驱动蛋白电机然后灌注进动力缓冲区 （12 毫米管道 [pH 6.8]，1 毫米 MgCl2、 2 毫米 EGTA 和 1 毫克/毫升的酪蛋白） 中，分庭含 2 毫米数码地面广播制式，2%葡萄糖，和 3 μ l"gloxy"来删除解决方案 （耶尔迪兹等人，2003年） 中的氧自由。与绿色荧光蛋白标记的电机在 1 毫米 ATP 使用全内反射荧光显微术，如在其他地方所述 (Reck 彼得森 et al，2006年） 进行了速度和运行的长度测量.

高精度荧光跟踪，独特的无功半胱氨酸被介绍了在催化核心 (E215C)透析的电机被标记的生物素-马来酰亚胺 (EZ 链接 PEO2，皮尔斯） 在 0.5 biotins 每头 （2 小时，4 ° C）、 反应淬火以 2 毫米数码地面广播制式，和生物素的过剩中移除了通过微管亲和纯化。微管-绑定，素驱动蛋白电机被孵化与 400 毫微米镀链霉亲和量子点 (655 nm，Invitrogen) 5 分钟内没有的流分庭的三磷酸腺苷 (反应对执行的微管绑定驱动蛋白，避免从多价量子点的聚合）。该示例包含 2-巯基乙醇 140 毫米的成像缓冲区与被冲走。电机速度一直在 10-15 nm/s 的范围内通过添加不同浓度的 ATP 每个构造 （见图 3 图例）。在这样的速度，我们可以尽量减少评分两个连续的步骤，作为一个"大一步，"由于电机的平均停留时间 (950 ms) 是长，相比的时间分辨率 （70 毫秒）。我们一步检测程序停留期间组成的三个数据点 (210 ms) 的分数。在这种时间分辨率，我们估计只有 2%的我们得分步骤将由于接二连三地的两个步骤。我们还比较步进的不同构造类似平均停留时间尽量减少项目 (如有选择性地得分两个步骤作为一个大步骤为一个构造)。

到脖子-链接器区域的交联 C 总站、 半胱氨酸被介绍给位置 337 13 P 无半胱氨酸突变体 (Cys-13 P)。净化 Cys-13 P （2 μ M） 为 30 分钟的 2 毫米 TCEP 治疗和通过海水化淡的列 （NAP5，GE 医疗集团），然后被传递，双马来酰亚胺交联剂 （BMOE，皮尔斯) 被添加等摩尔比到电机 4 小时 80 毫米管道 (pH 7.0)，在 100 mM NaCl、 MgCl2，1 毫米和 1 毫米 EGTA 在 4 ° c。其余的交联剂以 10 毫米数码地面广播制式 30 分钟淬火.