Human fibroblasts were obtained fro

Human fibroblasts were obtained from commercial sources (Supplementary Table S3) and
maintained in fibroblast medium (DMEM supplemented with 10% or 15% fetal bovine
serum and penicillin/streptomycin) according to the vendor’s instructions for cell culture.
Cells were seeded onto gelatin-, fibronectin-, or Matrigel-coated culture vessels (4.8×105
per
24- or 48-well plate, or 8×105
per 10-cm dish) with or without glass cover slips. They were
transduced the next day with retroviral supernatants in the presence of 6 μg/ml polybrene.
After overnight incubation, culture media were refreshed. One day later, the cells were then
switched to C2 medium, which consists of DMEM:F12:Neurobasal (2:2:1), 0.8% N2
(Invitrogen), 0.4% B27 (Invitrogen), and penicillin/streptomycin. Screens for small
molecules were conducted by incubating the indicated chemicals (Supplementary Table S1)
in C2 medium for 5 days starting at 2 days post infection (dpi). The resulting neural
induction medium for human fetal fibroblasts consist of DM (1 μM, from 2 dpi to 6 dpi) and
FSK (10 μM) in C2 medium. For postnatal and adult human fibroblasts, FGF2 (10 ng/ml)
and DM was included in the above induction medium from 2 dpi to 12 dpi. Induction
medium was half-changed every other day. For inducible expression, cells were transduced
overnight with lentiviruses. The day after medium change, Dox (0.1 μg/ml) was added to
induce gene expression for the indicated period of time during the course of reprogramming.
For gene expression analysis, electrophysiology, or coculture with myotubes, induced
neurons were purified by differential plating. Briefly, cells at 14-21 dpi were rinsed with
DPBS and dissociated with 0.025% trypsin for 15 minutes at 37°C. After blocking trypsin
activity with FBS-containing fibroblast medium, the cell suspension was plated onto a
gelatin-coated culture dish, to which fibroblasts tightly attached. About 30 min later, floating
cells, which mainly consisted of induced neurons, were replated onto a new coated dish to
remove residual fibroblasts or were directly collected by centrifugation at 500 g for 2 min.
Cells were resuspended into C2 medium and centrifuged again to remove cell debris.
Finally, cells were plated onto a coated dish in C2 medium supplemented with BDNF,
GDNF and NT3 (10 ng/ml each, Peprotech). Unless indicated otherwise, C2 media with
neurotrophic factors were half-changed twice a week. The human neural stem cell line,
K048, was a kind gift of Dr. P. Wu (UT Medical Branch) and Dr. C.N. Svendsen
(University of Wisconsin).

結果 (中文) 1:

人成纤维细胞得到从商业来源 (补充表 S3) 和保持在碱性成纤维细胞培养基 (DMEM 辅以 10%或 15%胎牛血清和青霉素/链霉素） 根据供应商的说明进行细胞培养。细胞接种到明胶、 纤维连接蛋白或涂覆基底膜培养容器 (4.8 × 105每个24 或 48 井板或 8 × 105每道菜 10 厘米） 有或无玻璃盖玻片。他们是转导与逆转录病毒上清液在凝聚胺 μ g/m l 月 6 日第二天。过夜孵育后文化媒体已经被刷新。一天后，细胞然后切换到 C2 中的介质，包括 DMEM:F12:Neurobasal （浸膏） 0.8%N2(Invitrogen) 0.4 %b27 (Invitrogen) 和青霉素/链霉素。小的屏幕分子进行孵化指示的化学品 (补充表 S1)在 C2 介质为 5 天，开始在 2 天后感染 (dpi)。由此产生的神经人胎儿成纤维细胞的诱导培养基包含 DM (1 μ M，从 2 dpi 到 6 dpi) 和FSK (10 μ M) C2 介质中。对于产后与成人人成纤维细胞，FGF2 (10 吴/ml)与 DM 被列入上述的诱导培养基从 2 dpi 到 12 dpi。感应媒介是半改变每隔一天。为诱导表达，细胞的转导一夜之间与慢病毒。天后介质改变，Dox (0.1 μ g/m l) 被添加到诱导指示的时间段的重编程过程中的基因表达。基因表达分析、 电生理，或与肌管共培养，诱导由微分电镀，神经元进行纯化。简单地说，在 14-21 dpi 细胞冲洗新方案和 0.025%胰蛋白酶与分开的 15 分钟在 37 ° c。阻断胰蛋白酶后活动与胎牛血清含碱性成纤维细胞中，细胞悬浮液镀上明胶涂层培养皿，到紧密贴合的成纤维细胞。约 30 分钟后，浮动细胞，其中主要包括诱导神经元，被 replated 上新涂层菜到删除剩余的成纤维细胞或直接在 500 克 2 分钟离心收集。细胞再入 C2 介质悬浮，再离心，去除细胞碎片。最后，细胞被镀上 C2 培养基与 BDNF，涂层的一道菜GDNF 和 NT3 (10 吴/ml，每个 peprotech 公司)。除非注明，C2 的媒体神经营养因子是半变了一周两次。人类神经干细胞线，K048，是体育吴博士 （UT 医学分会） 和博士到 Svendsen 类的礼物（威斯康星大学）。

結果 (中文) 2:

从商业来源（补充表S3）获得与人成纤维细胞
保持在成纤维细胞培养基（DMEM补充有10％或15％胎牛血清的
根据用于细胞培养的供应商的说明血清和青霉素/链霉素）。
细胞接种到明胶，纤连蛋白，或基质胶包被的培养容器中（4.8×105
每
24或48孔板，或8×105
每10-cm培养皿）具有或不具有玻璃盖玻片。他们被
转导，第二天与6微克/毫升聚凝胺存在下逆转录病毒上清液。
隔夜培养后，培养基被刷新。一天后，将细胞再
切换到C 2平台，它由DMEM中：F12：的Neurobasal（2：2：1），0.8％N 2
（Invitrogen公司），0.4％B27（Invitrogen）和青霉素/链霉素。对于小屏幕
的分子被孵育表示化学品（补充表S1）进行
的C2培养基开始于2天5天感染后（DPI）。将所得神经
对人胎儿成纤维细胞诱导培养基组成的DM（1μM，从2 dpi的至6 dpi）再
FSK（10μM）中的C2培养基。为产后和成年人成纤维细胞，FGF2（10毫微克/毫升）
和DM被包括在上述诱导培养基由2 dpi的12 dpi的。诱导
培养基半改为隔日1次。为诱导表达，将细胞转导
用慢病毒过夜。更换培养基后的第二天，加入霉素（0.1微克/毫升），以
诱导基因表达的时间重编程的过程中所指示的时间。
用于基因表达分析，电，或共培养与肌管，诱发
的神经元通过差电镀纯化。简言之，将细胞在14-21 dpi及漂洗
DPBS并用0.025％胰蛋白酶解离，在37℃下15分钟。阻塞胰蛋白酶后
用含有FBS的成纤维细胞培养基的活性，该细胞悬浮液接种到
明胶包被的培养皿中，向其中成纤维细胞紧密附接。约30分钟后，漂浮的
细胞，其主要由诱导的神经元，再接种到新的涂覆培养皿
去除残留的成纤维细胞或离心以500g直接收集2分钟。
细胞重悬于C2介质并再次离心以去除细胞碎片。
最后，将细胞铺板于在C2介质涂覆培养皿补充有BDNF，
GDNF和NT3（10纳克/毫升，Peprotech公司）。除非另外指出，否则的C2媒体
神经营养因子一周半更换两次。人类神经干细胞系，
K048，是P.吴博士（UT医学部）和CN斯文森博士惠赠
（威斯康星大学）。

結果 (中文) 3:

从商业来源获得的人类成纤维细胞（补充表S3）和保持在成纤维细胞中（DMEM高糖培养基10%或15%胎牛血清和青霉素/链霉素）根据细胞培养供应商的说明。细胞接种在明胶，纤连蛋白，或Matrigel培养容器（4.8×105每24 -或48孔板，或105 - 8每10厘米碟形）带或不带玻璃盖。他们是将二天与逆转录病毒上清液中存在的6μ克/毫升血。通宵孵育后，文化传媒被刷新。一天之后，细胞又被切换到C2中，包括培养基：F12：Neurobasal（2:2:1），0.8% N2（Invitrogen），0.4% B27（Invitrogen），和青霉素/链霉素。屏幕小分子是由指定的化学品进行孵化（补充表S1）5天开始在感染后2天在C2中（DPI）。由此产生的神经人胎儿成纤维细胞的诱导培养基为DM（1μM，从2部到6部），频移键控（10μM）在C2中。产后和成人成纤维细胞，成纤维细胞生长因子（10纳克/毫升）DM是从2部到12部包括在上述诱导培养基。归纳媒体每隔一天就换一次。诱导表达，细胞转导在慢病毒。在介质变化的天，阿霉素（0.1μ克/毫升）被添加到在重编程过程中诱导基因表达的一段时间。用于基因表达分析、电生理、或共培养肌管，诱导采用差示电镀纯化神经元。简而言之，在14-21天细胞冲洗阻断后用0.025%胰蛋白酶和胰蛋白酶在15分钟的37°C. DPBS与FBS含有成纤维细胞中的活性，将细胞悬液接种到明胶涂层培养皿，其中成纤维细胞紧密连接。大约30分钟后，浮动细胞，它主要由诱导的神经元，分别接种到涂层的新菜去除残留的成纤维细胞，或直接收集通过离心在500克为2分钟。细胞悬浮在C2中离心去除细胞碎片再次。最后，细胞接种在培养基中添加在C2与脑源性神经营养因子涂一道菜，GDNF和NT-3（10毫微克/毫升，PeproTech）。除非另有说明，C2的媒体神经营养因子是一个星期两次。人神经干细胞系，k048，是一种P. Wu博士的礼物（UT医学分支）和C.N. Svendsen博士（威斯康星大学）。