3.2. Keap1 deletion-mediated Smad7

3.2. Keap1 deletion-mediated Smad7 elevation is responsible for TGF-βsignaling suppression in MES-13 cellsTo elucidate the underlying molecular events in Nrf2-mediated TGFβ suppression, we determined the levels of molecules associated withthe canonical pathway of TGF-β signaling. First, among two types ofTGF-β receptors, the protein levels of TβRI were substantially diminished in shKeap1 cells as compared to the control cells (Fig. 2A). Therewas no noticeable difference in TβRI mRNA levels between shKeap1cells and the control cells (Supplementary Fig. S4). Moreover, repressedTβRI levels in shKeap1 cells were partially restored by proteasome inhibitor treatment (Supplementary Fig. S4), which suggests that TβRIreduction was done at the post-translational stage. Second, among themeasured Smad protein levels, it was notable that Smad7 levels weresignificantly high in shKeap1 cells (Fig. 2B). However, mRNA levels forSmad7 were not changed by Keap1 knockdown (Fig. 2C). The Nrf2-dependent Smad7 elevation was confirmed by the Nrf2 silencing: thetransfection of shKeap1 cells with Nrf2 siRNA abolished Smad7 elevation (Fig. 2D). These findings suggested that Smad7 elevation could beresponsible for the suppression of TGF-β signaling in Keap1 knockdownMES-13 cells. Indeed, when shKeap1 cells were transfected with siSmad7 (Supplementary Fig. S6), the expression of TβRI (which wasdiminished in shKeap1) was restored to the level of the control cells(Fig. 2E). Moreover, the levels of p-Smad2/p-Smad3 and fibrotic markers (fibronectin and α-Sma) were increased by si-Smad7 transfection(Fig. 2F). These results support the idea that activated Nrf2 is a positiveregulator of Smad7, and increased Smad7 inhibits TGF-β-induced fibrosis signaling by repressing TβRI level.

結果 (繁體中文) 1:

3.2。Keap1的缺失介導的Smad7的高程是負責TGFβ
信號傳導在MES-13細胞的抑制
為了闡明的Nrf2介導的TGFβ抑制底層的分子事件，我們確定與相關分子的水平
TGFβ信號傳導的經典途徑。首先，兩種類型的中
TGF-β受體，TβRI的蛋白水平基本上shKeap1細胞減少，因為與對照相比，細胞（圖2A）。有
在shKeap1之間TβRImRNA水平沒有顯著的差別
的細胞和對照細胞（補充圖S4）。此外，抑制
在shKeap1細胞TβRI水平通過蛋白酶體抑製劑治療（補充圖S4），這表明被部分恢復TβRI
還原在翻譯後階段進行。其次，中
測量的Smad蛋白水平，這是值得注意的是，Smad7的水平
在shKeap1細胞（圖2B）顯著高。然而，mRNA水平，
Smad7的沒有被擊倒Keap1的（圖2C）改變。所述Nrf2-
依賴Smad7的高程確認由Nrf2的沉默：在
shKeap1細胞與Nrf2的siRNA的轉染廢除Smad7的高程（圖2D）。這些結果表明，Smad7的抬高可能是
負責TGF-β信號在Keap1的擊倒壓制
MES-13細胞。事實上，當shKeap1細胞用siSmad7（補充圖S6），TβRI的表達（其轉染
在shKeap1減少）已恢復到所述控制單元的水平
（圖2E）。此外，P-Smad2的苯乙烯/對- Smad3蛋白和纖維化標記物（纖連蛋白和α-SMA）的水平分別提高了SI-Smad7的轉染
（圖2F）。這些結果支持了活化Nrf2的是正的想法
Smad7的的調節器，並且通過抑制TβRI水平增加Smad7的抑制TGF-β誘導的纖維化信令。

結果 (繁體中文) 2:

3.2. Keap1 刪除介導的 Smad7 高程負責 TGF-α
MES-13細胞中的信號抑制
為了闡明Nrf2介導TGf®抑制中潛在的分子事件，我們確定了與
TGF-α信號的規範通路。首先，在兩種類型中
與對照細胞相比，TGF-+受體在shKeap1細胞中T_RI的蛋白質水準顯著降低（圖2A）。那裡
在 shKeap1 之間的 T_RI mRNA 水準沒有顯著差異
細胞和控制單元（補充圖。S4）。此外，被壓抑
shKeap1細胞中的T_RI水準通過蛋白酶體抑制劑治療部分恢復（補充圖）。S4），這表明T_RI
在翻譯後階段進行了減少。第二，在
測量的Smad蛋白水準，值得注意的是，Smad7水準
shKeap1細胞中顯著高（圖2B）。但是，mRNA 水準
Smad7 未因 Keap1 擊倒而改變（圖 2C）。The Nrf2-
依賴Smad7海拔被Nrf2沉默確認：
轉染具有Nrf2 siRNA的shKeap1細胞，廢除了Smad7升高（圖2D）。這些發現表明，Smad7高程可能是
負責抑制Keap1擊倒中的TGF-+信令
MES-13細胞。事實上，當shKeap1細胞被轉染與siSmad7（補充圖。S6），T_RI 的表達（這是
在 shKeap1 中減少，恢復到控制單元的水準
（圖 2E）。此外，p-Smad2/p-Smad3 和纖維化標記（纖維質和 β-Sma）的水準通過si-Smad7轉染而增加
（圖2F）。這些結果支援了啟動 Nrf2 是一個積極的想法
Smad7 的調節器，增加的 Smad7 通過抑制 T_RI 水準抑制 TGF-β 誘導纖維化信號。

結果 (繁體中文) 3:

3.2條。Keap1缺失介導的Smad7升高與TGF-β有關
MES-13細胞的訊號抑制
為了闡明Nrf2介導的TGFβ抑制的潜在分子事件，我們測定了與
TGF-β信號傳導的典型途徑。首先，在兩種類型中
TGF-β受體，與對照細胞相比，shKeap1細胞中TβRI的蛋白水准顯著降低（圖2A）。在那裡
shKeap1與shKeap1的TβRI mRNA水准無明顯差异
細胞和對照細胞（補充圖S4）。而且，被壓抑
蛋白酶體抑制劑治療可部分恢復shKeap1細胞中的TβRI水准（補充圖S4），這表明TβRI
在翻譯後階段進行還原。第二，在
測定Smad蛋白水准，值得注意的是Smad7水准
shKeap1細胞顯著增高（圖2B）。然而，對於
Keap1基因敲除並沒有改變Smad7（圖2C）。Nrf2-
通過Nrf2沉默確認了相關Smad7的升高：
用Nrf2 siRNA轉染shKeap1細胞可消除Smad7的升高（圖2D）。這些發現提示Smad7的升高可能是
抑制Keap1基因敲除過程中TGF-β信號轉導
MES-13細胞。事實上，當shKeap1細胞被siSmad7轉染時（補充圖S6），TβRI的表達
shKeap1）的减少恢復到對照細胞水准
（圖2E）。此外，轉染si-Smad7後，p-Smad2/p-Smad3和纖維化標誌物（纖維連接蛋白和α-Sma）的水准升高
（圖2F）。這些結果支持啟動的Nrf2是陽性的觀點
Smad7的調節和Smad7的新增通過抑制TβRI水准抑制TGF-β誘導的纖維化信號傳導。