An NSP2 miR171c-resistant version w

An NSP2 miR171c-resistant version was generated using primers 59-tTT-
aAGgCGcACgAggATaACaCGAGCCAGTTCaCGGT-39 (reverse) and 59-TtAT ccTcGTgCGcCTtAAaGAGTTGGTGTCCCACACCGAC-39 (forward) carrying silent mutations (lowercase letters) in and near the miR171c complementary region of the coding sequence with primers 59-caccCTCAGGCATGGAAATGGA-39 (forward) and 59-TTCTGTTTTCGGAAGGTCAA-39 (reverse),respectively, to PCR amplify mutated 59 and 39 fragments of the gene from L. japonicus leaf DNA (ecotype Gifu). A full-length version was obtained from these using an overlapping PCR strategy with primers 59-caccCTCAGGCATGGAAATGGA-39 (forward) and 59-TTCTGTTTTCGGAAGGTCAA-39 (reverse). The same primers and template were used to isolate full-length wild-type NSP2. Both fragments were subsequently cloned into pENTR/D/TOPO (Invitrogen) and transferred to modified pIV10 vector (Stougaard et al.,1987)equipped with a Gateway destination cassette (Invitrogen) preceded by a 405-nucleotide cauliflower mosaic virus 35S promoter fragment (59-CGTACCCCTACTCCAAAAATG.TTCATTTGGAGAGGACAGCCC-39). As a control, the Gateway destination cassette was eliminated from the pIV10 plasmid carrying the 35S promoter fragment. The resulting pIV10-based constructs were introduced into A. rhizogenes AR1193 via triparental mating (Stougaard et al., 1987)and used for hairy root induction.

結果 (中文) 1:

MiR171c 耐版本使用引物 59-tTT-生成 NSP2
aAGgCGcACgAggATaACaCGAGCCAGTTCaCGGT-39 （反转） 和 59-TtAT ccTcGTgCGcCTtAAaGAGTTGGTGTCCCACACCGAC-39 （向前） 携带沉默突变 （小写字母） 和近 miR171c 补充区域的编码序列引物 59-caccCTCAGGCATGGAAATGGA-39 （向前） 和 59-TTCTGTTTTCGGAAGGTCAA-39 （反转）分别到 PCR 放大变异的 59 和 39 基因片段的从 L.竹节叶 DNA (生态型岐阜）。全长版本是从这些使用重叠 pcr 技术战略与引物 59-caccCTCAGGCATGGAAATGGA-39 （向前） 和 59-TTCTGTTTTCGGAAGGTCAA-39 （反转） 获得的。相同的引物和模板用于隔离全长野生型 NSP2。这两个片段后来被克隆成 pENTR/D/TOPO (Invitrogen) 和转移到修改的 pIV10 矢量 (Stougaard et al.，1987年） 配有网关目的地卡带 （Invitrogen） 之前，405 核苷酸花椰菜花叶病毒 35S 启动子片段 (59-CGTACCCCTACTCCAAAAATG。TTCATTTGGAGAGGACAGCCC-39）。作为一种控件，网关目的地卡带就 pIV10 质粒 35S 启动子片段被淘汰了。由此产生的基于 pIV10 的构造是 A.发根 AR1193 triparental 交配 (Stougaard et al.，1987年） 通过引入，用于毛状根诱导。

結果 (中文) 2:

使用引物59-TTT-生成了NSP2 miR171c耐版本
aAGgCGcACgAggATaACaCGAGCCAGTTCaCGGT-39（反向）和59-TtAT ccTcGTgCGcCTtAAaGAGTTGGTGTCCCACACCGAC-39（正向）携带沉默突变（小写字母），接近编码序列的miR171c互补的区域用引物59-caccCTCAGGCATGGAAATGGA-39（正向）和59-TTCTGTTTTCGGAAGGTCAA-39（反向），分别进行PCR扩增该基因的突变的59和39的片段从百脉根叶DNA（生态型岐阜）。从这些使用重叠PCR策略，用引物59-caccCTCAGGCATGGAAATGGA-39（正向），获得的全长版本和59-TTCTGTTTTCGGAAGGTCAA-39（反向）。相同的引物和模板进行分离全长的野生型NSP2。两个片段随后被克隆到pENTR / D / TOPO（Invitrogen）中，并转移到改性pIV10矢量（Stougaard等人，1987）配备一个网关的目的地盒（Invitrogen）的前面有一个405个核苷酸的花椰菜花叶病毒35S启动子片段（ 59-CGTACCCCTACTCCAAAAATG.TTCATTTGGAGAGGACAGCCC-39）。作为对照，网关目的地盒从pIV10质粒携带的35S启动子片段销。所得pIV10基于构建体引入发根农杆菌AR1193通过三亲交配（Stougaard等人，1987），并用于发根诱导。

結果 (中文) 3:

一个高抗mir171c版本是用引物59 TTT
aaggcgcacgaggataacacgagccagttcacggt-39产生（反向）和59（前）的方法cctcgtgcgccttaaagagttggtgtcccacaccgac-39携带沉默突变（小写字母）和附近的引物59-caccctcaggcatggaaatgga-39编码序列的mir171c互补区（前）和59-ttctgttttcggaaggtcaa-39（反向），分别以PCR扩增，突变的59和39从百脉根叶片DNA的基因片段（生态型岐阜）。从这些使用重叠PCR引物59-caccctcaggcatggaaatgga-39策略获得了全长版（向前）和59-ttctgttttcggaaggtcaa-39（反向）。相同的引物和模板进行分离全长野生型Nsp2。两个片段进行克隆到pENTR／D／TOPO（Invitrogen公司）和转移到改性piv10向量（stougaard等人。，1987）配备了一个网关目标盒（Invitrogen公司）在一个405个核苷酸的花椰菜花叶病毒35S启动子片段（59-cgtacccctactccaaaaatg。ttcatttggagaggacagccc-39）。作为一个控制，目的地的网关盒从piv10质粒的35S启动子片段的消除。由此产生的piv10为基础的结构被引入到发根农杆菌ar1193通过三亲交配（stougaard等人。，1987）和用于毛状根诱导。