We then tested whether “external” t

We then tested whether “external” tension from the optical trap might substitute for the loss of “internal” tension in the extended kinesin mutants, and thus restore chemomechanical coupling. Using a force-clamp optical trap (Gennerich et al., 2007), a constant 3, 6, or 9 pN assisting load was applied toward the microtubule plus end, kinesin's normal direction of travel. Because of the geometry of the experiment (diagram, Figure 4B), the applied load is primarily “felt” by the trailing head. For WT kinesin under a forward load of up to 9 pN, the velocity of movement remained largely unchanged (Figure 4C), as reported elsewhere (Block et al., 2003). If the extended kinesins move slowly under unloaded conditions because they cannot effectively detach the trailing head and pull it forward, we reasoned that the assisting load might increase their velocity of movement. Indeed, assisting loads dramatically increased the velocity of extended kinesins by several fold at 1 mM ATP. Inspection of the traces revealed that motion occurred in a step-wise manner (inserts in Figure 4B; step size analysis at lower ATP concentrations in Figure S8). At 6 pN forward load, the velocity of 13P, 14GS, and 26P approached that of WT kinesin, and at 9 pN, the extended kinesin constructs moved even faster than WT (Figure 4C). The higher velocities might be explained by the ability of extended kinesins to take larger steps. With the relatively low Brownian noise at 9 pN load, we could measure the center-of-mass step sizes (expected to be half as large as the displacement of individual kinesin heads shown in Figure 3) for 26P and WT kinesin at saturating ATP (Figure S9). Figure 4D shows that 26P takes >8 nm steps with a 9 pN assisting load and thus its average step size (11.51 nm) is larger than that of WT kinesin (7.98 nm). We also found no clear backward steps (of 302 steps scored) at this assisting load. From these data, we calculated stepping rates for WT (56.2 s-1: 449 nm/s velocity divided by a 7.98 nm step) and 26P kinesin (54.73 s-1: 630 nm/s velocity divided by an 11.51 nm step). These similar stepping rates reveal that the 9 pN forward load rescues the coupling deficiency of the 26P extended kinesin.

結果 (中文) 1:

然后我们测试了从光学陷阱“外部”拉力是否可能取代“内部”张力在扩展驱动蛋白突变体的损失，化学机械耦合，从而恢复。使用一个光阱力钳（gennerich等，2007年），一个常数3，6，或9 PN协助负载应用向微管正端，驱动蛋白的正常行驶方向。因为实验（原理图，图4b）的几何形状，所施加的负载主要是“感觉”的后头部。为：（重量），驱动蛋白9的pn根据远期负荷的移动速度大致保持不变（图4c），报道（块等人，2003）。如果扩展动蛋白在空载条件下慢慢移动，因为他们不能有效地分离尾随头向前拉，我们的理由是，协助负荷可能会增加他们的运动速度。的确，协助负荷急剧增加数倍的速度扩展动蛋白在1毫米ATP。的痕迹进行检查发现，运动发生在一个阶梯状的方式（图4b中的插入;步长分析在图s8的ATP浓度较低）。 6 pn正向的负载，13p的速度，14gs，26P接触，驱动蛋白（重量），和9的pn，扩展的驱动蛋白结构即使移动的速度比（重量）（图4c）。可能被解释为更高的速度扩展动蛋白的能力，采取更大的步骤。布朗噪声在9的pn负载相对较低，我们可以测量质量中心的步长（预期的一半一样大的位移头在图3中所示的单独的驱动蛋白）在饱和为26P和重量动蛋白ATP（图S9）。图4d表明，26P> 8nm的步骤与9的pn辅助负载，因此，其平均步长（11.51 nm）的比（重量），驱动蛋白（7.98 nm）的大。我们也没有发现明显的退步（302步拿下）在此协助负荷。从这些数据，我们步进率重量（56.2 S-1：449纳米/ s的速度由7.98 nm的步骤分为）和26P动蛋白（54.73 S-1的计算：除以630纳米/秒的速度11.51 nm的步骤）。这些类似的步进率显示，9 PN前锋负载耦合26P扩展驱动蛋白缺乏救援。

結果 (中文) 2:

然后我们测试是否“从光阱外”的紧张可能替代“在扩展蛋白突变体的内部张力的损失，从而恢复力-化学耦合。使用力夹光阱（gennerich等人。，2007），一个恒定的3，6，或9 PN协助负载被施加朝向微管正端，驱动蛋白的旅行方向。由于实验的几何形状（图，图4b），所施加的载荷主要是“感觉”的尾头。WT驱动蛋白多达9 PN正向载荷作用下，运动速度基本上保持不变（图4C），据地方（块等人。，2003）。如果扩展驱动蛋白卸载条件下缓慢移动的因为他们不能有效地卸除拖头向前推，我们推断，协助负载会增加他们的运动速度。事实上，协助负载大大增加的速度成倍延长驱动蛋白在1毫米ATP。的痕迹的检查显示，运动发生在一个逐步的方式（图4b；插入图S8）ATP浓度较低的步长分析。在6 PN提出的负载，速度14gs 13P，开发，和接近的WT驱动蛋白，和在9 PN，扩展的驱动蛋白构建移动更快比WT（图4C）。更高的速度可以通过扩展的驱动蛋白采取更大的步骤解释能力。与相对较低的热噪声在9 PN力，我们可以测量步长的质量中心（预计的一半大，单个驱动蛋白位移头如图3所示）用于开发和WT驱动蛋白在饱和的ATP（图S9）。图4显示，开发以> 8 nm的步骤与9 PN协助负荷，使平均步长（11.51 nm）高于WT驱动蛋白（7.98 nm）。我们也没有发现明显的落后的步骤（302步进）在协助负载。从这些数据，我们计算步进率（56.2 s-1的重量：449 nm / s的速度除以7.98 nm的步骤和驱动蛋白（54.73 s-1）开发：630 nm / s的速度由一分为11.51 nm的步骤）。这些类似的步进率表明，9 PN正向加载抢救的开发扩展驱动蛋白耦合不足。

結果 (中文) 3:

然后，我们测试是否"外部"紧张从光学陷阱可能取代损失的"内部"紧张局势扩展驱动蛋白突变体，并因此恢复 chemomechanical 耦合。使用武力夹光阱 （根内里希 et，2007年），协助负载常数 3、 6 或 9 pN 是向着微管加上结束，旅行的驱动蛋白的正常方向应用的。由于实验 (图，图 4B) 的几何形状，应用的负载是主要"感受"尾随的头。驱动蛋白 WT 的达 9 pN 向前负载下，运动的速度仍大致保持不变 （图 4），正如报告其他地方 （块等，2003年）。如果扩展的驱动蛋白卸载条件下移动慢慢地，因为他们不能有效地分离的尾随头和向前拉它，我们推想协助负载可能会增加他们的运动速度。事实上，协助负荷急剧增加扩展的驱动蛋白的速度在 1 毫米 ATP 的几倍。痕迹检验显示议案发生以循序渐进的方式 （图 4B 中的插入 ； 一步大小分析在图 S8 中 ATP 浓度较低）。在 6 pN 远期负荷、 13 P、 14GS 和 26 P 的速度接近的 WT 驱动蛋白，并且在 9 pN 的扩展驱动蛋白构造甚至高于 WT (图 4)。采取更大步骤扩展的驱动蛋白的能力可能可以解释的更高的速度。与布朗噪音在 9 pN 负荷相对较低，我们可以衡量的中心的大众步长 （预计将有一半一样大位移的个别驱动蛋白元首图 3 所示） 26 P 和 WT 驱动蛋白在饱和 ATP （图 S9）。图 4 显示了 26 P 花 > 8 毫微米步骤与 9 协助负载，从而其平均步长 pN (1151 毫微米) 大于那 WT 驱动蛋白 (7.98 毫微米)。我们也发现没有明显落后 (302 步骤得分) 的步骤在此协助的负载。从这些数据，我们计算步进价格为 WT (56.2 s-1： 449 nm/s 速度除以 7.98 nm 步） 和 26 P 驱动蛋白 (54.73 s-1：除以 11.51 nm 步的 630 nm/s 速度）。这些类似的步进率揭示 9 pN 向前负载救 26 P 扩展驱动蛋白的耦合缺失。