Amplification of the rpoB Gene from

Amplification of the rpoB Gene from Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni. Genomic DNA of L. plantarum and O. oeni was isolated from a single colony, with the Microbial DNA extraction kit (CABRU, Milan, Italy) according to manufacturerÕs procedure. For the PCR experiment, about 100 ng of genomic DNA was added to a 50-(L PCR mixture containing 1.25 U of Taq polymerase (Qiagen, Milan, Italy) 0.2 mM of each dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 10 mM Tris-HCl pH
8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , and 0.4 mM of primers rpoB1 (ATTGACCACTTGGGTAACCGTCG), rpoB1O (ATCGATCACTTAGGCAATCGTCG), and rpoB2 (CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACGATCACGGGTCAAACCACC) [19, 20]. Primer rpoB2 has a GC-rich clamped DNA sequence in order to avoid duplex DNA problems and to improve detection of
single-base changes [21]. The reaction mix was cycled through the following temperature profile: 94°C 5 min; 94°C 1 min; 58°C 1 min; 72°C 1 min for the first 15 cycles, then 15 cycles at 52°C as annealing temperature. The PCR reaction was terminated at 72°C for 10 min and thereafter cooled to 4°C.

結果 (中文) 1:

从酒酒球菌和杆菌 rpoB 基因的扩增。O.球菌和杆菌的基因组 DNA 是孤立的从单个菌落，与微生物 DNA 提取试剂盒 （CABRU，意大利米兰） 按照制造商的程序。聚合酶链反应实验中，大约 100 吴的基因组 DNA 被添加到 50-（L PCR 混合物含有 1.25 U Taq 聚合酶 （Qiagen，米兰，意大利） 每个 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP、 10 毫米三 HCl ph 值 0.2 毫米8.3，50 毫米氯化钾、 氯化镁 2，1.5 m m 和 0.4 m m 的引物 rpoB1 (ATTGACCACTTGGGTAACCGTCG)，rpoB1O (ATCGATCACTTAGGCAATCGTCG) 和 rpoB2 (CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGCACGATCACGGGTCAAACCACC) [19，20]。底漆 rpoB2 拥有丰富的 GC 夹紧的 DNA 序列，避免双面 DNA 问题，完善的检测单碱基变化 [21]。反应混合循环温度以下配置文件 ︰ 94 ° C 5 分钟;94 ° C 1 分钟;58 ° C 1 分钟;72 ° C 首先 15 个周期为 1 分钟，然后 15 周期在 52 ° C 作为退火温度。PCR 反应终止在 72 ° C 10 分钟，此后冷却至 4 ° c。

結果 (中文) 3:

从植物乳杆菌和酒酒球菌扩增rpoB基因。对植物乳杆菌和O.球菌基因组DNA从一个单菌落分离，与微生物DNA提取试剂盒（cabru，米兰，意大利）根据制造商Õ程序。用于PCR实验，约100 ng基因组DNA加入到50（含1.25 U Taq聚合酶L PCR混合物（Qiagen公司，米兰，意大利）0.2毫米每dATP、dTTP、dGTP、dCTP、10 mM Tris-HCl pH8.3、50毫米氯化钾，1.5毫米和0.4毫米的MgCl 2、引物rpob1（attgaccacttgggtaaccgtcg），rpoB1O（atcgatcacttaggcaatcgtcg），和rpoB2（cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacgggggggcacgatcacgggtcaaaccacc）[ 19，20 ]。底漆rpoB2有富含GC固定DNA序列以避免双链DNA的问题及提高检测单碱基变化[ 21 ]。反应混合物循环通过以下温度：94°C 5分钟；94°C 1分钟；58°C 1分钟；72°C 1分钟前15周期，15周期在52°C退火温度。pcr反应在72°C下被终止，10分钟后冷却至4°C。