SDS-PAGE AnalysisReagents RequiredR

SDS-PAGE Analysis
Reagents Required
Recipes are provided in Appendix 3, page 31.
6X SDS Loading Buffer
1. Remove 10 μl of each supernatant from Step 14 (above)
to fresh tubes.
2. To these aliquots, and to the 10 μl samples retained
following steps 7 and 9 (above), add 2 μl of 6X SDS
Loading Buffer.
3. Vortex briefly and heat for 5 minutes at 90-100°C.
4. Load the samples onto a 10-12.5% SDS-polyacrylamide gel.
5. Run the gel for the appropriate length of time and stain
with Coomassie Blue to visualize the parental GST (made
in control cells carrying the parental pGEX vector) and
the fusion protein.
– Note: Transformants expressing the desired fusion protein
will be identified by the absence from total cellular
proteins of the parental 29 kDa GST and by the presence
of a novel, larger fusion protein. Parental pGEX
vectors produce a 29 kDa GST fusion protein containing
amino acids coded for by the pGEX MCS.
If the above analysis indicates that the fusion protein has
adsorbed to the Glutathione Sepharose 4B, proceed to largescale
purification as described in Procedure 11. If, on the
other hand, the fusion protein is absent from the purified
material, it may be insoluble or expressed at very low levels;
refer to the Troubleshooting Guide (page 24) for a discussion
of this problem. Interpretation is sometimes complicated
when fusion proteins break down and release the 26 kDa
GST moiety. Such cases are usually recognized by the reduced
level of the 26 kDa species, and by the series of larger, partial
proteolytic fragments above it.

結果 (繁體中文) 1:

SDS — PAGE 分析所需的試劑在附錄 3 中，第 31 頁提供了食譜。6 X SDS 載入緩衝區1.從步驟 14 （以上） 中刪除每個上清液 10 μ 的 l新鮮的管。2.這些整除的以及對保留的 10 μ l 樣本以下步驟 7 和 9 （上圖），加入 2 μ l 6 X 抑鬱自評量表載入的緩衝區。3.簡要的渦和加熱 5 分鐘在 90-100 ° c。4.載入到 10%至 12.5 %sds-聚丙烯醯胺凝膠樣品。5.運行適當長度的時間和染色凝膠考馬斯亮藍視覺化 （作父母的 GST在控制細胞攜帶父母不明顯向量） 和融合蛋白。— — 請注意︰ 轉化表達需的融合蛋白將由總細胞中沒有標識蛋白質的父母 29 kDa GST 和存在新穎、 更大的融合蛋白。父母不明顯向量產生 29 kDa GST 融合蛋白含編碼為的 MCS 明顯的氨基酸。如果上述分析表明，融合蛋白有吸附到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠 4B，著手進行大規模純化步驟 11 中所述。如果，在另一隻手，融合蛋白是缺席從純化材料，它可能是不溶性或表達水準很低;請參閱故障排除指南 （第 24 頁） 討論這一問題。解釋是有時複雜當融合蛋白分解和釋放 26 kDaGST 基團。這種情況下通常被認可的減少通過系列的較大，部分及 26 kDa 物種，級別它上面的蛋白水解片段。

結果 (繁體中文) 2:

SDS-PAGE分析
試劑所需的
配方在附錄3，第31頁提供
6X SDS上樣緩衝液
1。除去10微升從步驟14（上圖）每種上清液
至新鮮管中。
2。向這些等份，並以10微升樣品保留
以下步驟7和9（以上），添加6X的SDS 2微升
載入緩衝器。
3。短暫渦旋並加熱在90-100℃下5分鐘。
4。加載樣品到10-12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠。
5。運行的時間和污點適當長度的凝膠
用考馬斯藍進行可視化親GST（取得
和在攜帶親的pGEX載體的對照細胞）
的融合蛋白。
-注：表達所需融合蛋白的轉化
將由缺失來識別從總細胞
親本29 kDa的GST的蛋白質和由存在
的新穎的，更大的融合蛋白。父母的pGEX
載體產生含有29 kDa的GST融合蛋白
的氨基酸由質粒pGEX MCS編碼。
如果上述分析表明，該融合蛋白已
吸附於穀胱甘肽瓊脂糖4B，進行大規模
純化如如果在步驟11所述，上在
另一方面，該融合蛋白是從純化缺席
材料，它可以是不溶性的或表達在非常低的水平;
參照的故障指南（第24頁）要討論
這個問題。解讀有時是複雜的
，當融合蛋白分解並釋放出26 kDa的
GST部分。這種情況下，通常是由降低的認可
的26 kDa的物種的水平，並通過串聯越大，局部的
上方蛋白水解片段。

結果 (繁體中文) 3:

SDS-PAGE電泳分析所需試劑食譜是提供在附錄31，3頁。6x SDS電泳緩衝液1。從步驟14（以上）中除去每一個上清液的10個L新鮮管。2。這些等分，和10μL樣品保留步驟7和9（以上），加2μL 6 SDS上樣緩衝液。三.在90-100°C. 5分鐘簡要和熱渦4。負載樣品到10-12.5%，SDS聚丙烯醯胺凝膠。5。運行適當的時間和染色凝膠的凝膠用考馬斯亮藍想像父母的GST（使攜帶父母pGEX向量控制細胞）和融合蛋白。–注：表達所需的融合蛋白的轉化將被確定的情况下，從總的細胞父母的29 kDa GST蛋白的存在一種新的，更大的融合蛋白。父母的基因向量產生一個29 kDa的GST融合蛋白含有編碼的胺基酸由載體MCS。如果上述分析表明，融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sepharose 4B，進行大規模的純化過程中所描述的11。如果，在另一方面，融合蛋白是不存在的純化資料，它可能是不溶性的或在非常低的水准表示；參閱故障排除指南（第24頁）進行討論這個問題。解釋有時是複雜的當融合蛋白的分子量為26 kDa的分解和釋放GST部分。這種情況通常是公認的减少的26 kDa的物種水准，和更大的系列，部分上面的蛋白水解片段。