3.2. Keap1 deletion-mediated Smad7

3.2. Keap1 deletion-mediated Smad7 elevation is responsible for TGF-β signaling suppression in MES-13 cells To elucidate the underlying molecular events in Nrf2-mediated TGFβ suppression, we determined the levels of molecules associated with the canonical pathway of TGF-β signaling. First, among two types of TGF-β receptors, the protein levels of TβRI were substantially diminished in shKeap1 cells as compared to the control cells (Fig. 2A). There was no noticeable difference in TβRI mRNA levels between shKeap1 cells and the control cells (Supplementary Fig. S4). Moreover, repressed TβRI levels in shKeap1 cells were partially restored by proteasome inhibitor treatment (Supplementary Fig. S4), which suggests that TβRI reduction was done at the post-translational stage. Second, among the measured Smad protein levels, it was notable that Smad7 levels were significantly high in shKeap1 cells (Fig. 2B). However, mRNA levels for Smad7 were not changed by Keap1 knockdown (Fig. 2C). The Nrf2- dependent Smad7 elevation was confirmed by the Nrf2 silencing: the transfection of shKeap1 cells with Nrf2 siRNA abolished Smad7 elevation (Fig. 2D). These findings suggested that Smad7 elevation could be responsible for the suppression of TGF-β signaling in Keap1 knockdown MES-13 cells. Indeed, when shKeap1 cells were transfected with siSmad7 (Supplementary Fig. S6), the expression of TβRI (which was diminished in shKeap1) was restored to the level of the control cells (Fig. 2E). Moreover, the levels of p-Smad2/p-Smad3 and fibrotic markers (fibronectin and α-Sma) were increased by si-Smad7 transfection (Fig. 2F). These results support the idea that activated Nrf2 is a positive regulator of Smad7, and increased Smad7 inhibits TGF-β-induced fibrosis signaling by repressing TβRI level.

結果 (繁體中文) 1:

3.2。Keap1的缺失介導的Smad7的高程是負責TGFβ信號傳導在MES-13細胞為了闡明的Nrf2介導的TGFβ抑制底層的分子事件的抑制，我們確定與TGFβ信號傳導的經典途徑相關分子的水平。首先，兩種類型的TGF-β受體的中，TβRI的蛋白水平基本上shKeap1細胞減少，因為與對照相比，細胞（圖2A）。有在shKeap1細胞和對照細胞（補充圖S4）之間TβRImRNA水平沒有顯著差異。此外，在shKeap1細胞抑制水平TβRI通過蛋白酶體抑製劑治療（補充圖S4），這表明TβRI還原在翻譯後階段完成被部分恢復。第二，所測量的Smad蛋白水平之間，這是值得注意的是，Smad7的水平在shKeap1細胞（圖2B）顯著高。然而，mRNA水平，Smad7的沒有被擊倒Keap1的（圖2C）改變。所述Nrf2-依賴Smad7的高程確認由Nrf2的沉默：shKeap1細胞與Nrf2的siRNA的轉染廢除Smad7的高程（圖2D）。這些結果表明，Smad7的提升可能負責TGF-β信號在Keap1的擊倒MES-13細胞的抑制。事實上，當shKeap1細胞用siSmad7（補充圖S6）轉染，TβRI的表達（其在shKeap1減少）已恢復到所述控制單元的水平（圖2E）。此外，P-Smad2的苯乙烯/對 - Smad3蛋白和纖維化標記物（纖連蛋白和α-SMA）的水平分別提高了SI-Smad7的轉染（圖2F）。

結果 (繁體中文) 2:

3.2. Keap1刪除介導Smad7高程負責MES-13細胞中的TGF-+信號抑制為了闡明Nrf2介導TGfF+抑制中的基礎分子事件，我們確定了與TGF-α信號的規範通路相關的分子水準。首先，在兩種類型的TGF-β受體中，與對照細胞相比，shKeap1細胞中T_RI的蛋白質水準顯著降低（圖2A）。shKeap1細胞與對照細胞之間的T_RI mRNA水準無顯著差異（補充圖）。S4）。此外，通過蛋白酶體抑制劑治療，在shKeap1細胞中抑制的T_RI水準得到部分恢復（補充圖）。S4），這表明在翻譯後階段進行了T_RI的削減。其次，在測得的Smad蛋白水準中，值得注意的是smad7水準在shKeap1細胞中顯著高（圖2B）。然而，Smad7的mRNA水準沒有因Keap1擊倒而改變（圖2C）。Nrf2依賴Smad7高程由Nrf2沉默證實：用Nrf2 siRNA消除Smad7高程的shKeap1細胞的轉染（圖2D）。這些發現表明，Smad7升高可以負責抑制Keap1敲除MES-13細胞中的TGF-+信號。事實上，當shKeap1細胞被轉染與siSmad7（補充圖。S6），T_RI的表達（在shKeap1中減少）被恢復到控制單元的水準（圖2E）。此外，p-Smad2/p-Smad3和纖維化標記（纖維質和β-Sma）的水準通過si-Smad7轉染而增加（圖2F）。這些結果支援了啟動 Nrf2 是 Smad7 的正穩壓器的想法，並且通過增加 Smad7 通過抑制 T_RI 水準來抑制 TGF-β 誘導纖維化信號。

結果 (繁體中文) 3:

3.2條。Keap1缺失介導的Smad7升高是MES-13細胞TGF-β信號轉導抑制的機制之一，為了闡明Nrf2介導的TGF-β信號轉導抑制中的分子事件，我們測定了與TGF-β信號傳導典型途徑相關的分子水准。首先，在兩種TGF-β受體中，與對照細胞相比，shKeap1細胞的TβRI蛋白水准顯著降低（圖2A）。shKeap1細胞和對照細胞的TβRI mRNA水准沒有明顯差异（補充圖S4）。此外，蛋白酶體抑制劑治療可部分恢復shKeap1細胞中受抑制的TβRI水准（補充圖S4），這表明TβRI的减少是在翻譯後階段完成的。第二，在測定的Smad蛋白水准中，值得注意的是，shKeap1細胞中Smad7的水准明顯較高（圖2B）。然而，Keap1基因敲除並沒有改變Smad7的mRNA水准（圖2C）。Nrf2沉默證實了Nrf2依賴性Smad7的升高：用Nrf2 siRNA轉染shKeap1細胞可消除Smad7的升高（圖2D）。提示Smad7的升高可能與抑制Keap1基因敲除MES-13細胞TGF-β信號轉導有關。事實上，當用siSmad7轉染shKeap1細胞（補充圖S6）時，TβRI的表達（在shKeap1中减少）恢復到對照細胞的水准（圖2E）。此外，通過si-Smad7轉染，p-Smad2/p-Smad3和纖維化標記物（纖維連接蛋白和α-Sma）的水准新增（圖2F）。這些結果支持啟動的Nrf2是Smad7的陽性調節因數，Smad7的新增通過抑制TβRI水准抑制TGF-β誘導的纖維化信號傳導。