We also observed an inherent asymme

We also observed an inherent asymmetry in the force-induced movement, with faster velocities observed for an equal magnitude pull directed toward the microtubule plus end, compared with the minus end (Figure 5A). This result is consistent with the lower unbinding forces measured when kinesin is pulled toward the plus end, compared with the minus end (Uemura and Ishiwata, 2003) (see Discussion).

We next tested whether an applied force can induce movement in the presence of AMPPNP (a nonhydrolyzable ATP analog), which causes kinesin to bind more tightly to microtubules than in nucleotide-free conditions (Kawaguchi and Ishiwata, 2001), and ADP, which induces a weak binding state. With 1 mM AMPPNP, a 9 pN force was required to induce stepping toward the plus end, whereas higher forces of 12 pN were required to produce minus-end-directed stepping (Figure 5B). A 6 pN load, which induced stepping under nucleotide-free conditions, did not lead to stepping with 1 mM AMPPNP (Figure S11). In the presence of ADP, much lower forces of ∼1 pN were sufficient to move kinesin toward the plus end (see Experimental Procedures) (Figure 5C). The velocity of movement was dependent on the ADP concentration (Figure 5C, insert), which likely reflects the relative time that the microtubule-bound kinesin head spends in a nucleotide-free state (resistant to detachment with a 1 pN load) versus a weakly bound ADP state (see also Uemura and Ishiwata, 2003). Once again, a higher load (2 pN) was required to drive the movement toward the minus end in the presence of ADP. In contrast to Uemura and Ishiwata (2003), we found that lower forces (1–2 pN) are sufficient to allow head detachment with bound ADP, compared with their reported average unbinding forces of 3–4 pN. The higher force measured by Uemura and Ishiwata is likely explained by their use of a constantly moving trap (instead of a force-feedback trap), which leads to a rapidly increasing load and the measurement of larger forces (depending on the time constant of detachment). In summary, these experiments reveal that the amount of force required for stepping is most likely determined by the affinity of the rear kinesin head for the microtubule. In addition, there is a clear directional asymmetry for detachment under all nucleotide conditions, with less force required for trailing head detachment when the pull is in the normal direction of kinesin movement.

We next explored whether a pulling force might substitute for a force-inducing conformational change of the neck linker. To test this idea, we deleted the native neck linker sequence that docks onto the catalytic core and added 19 prolines to act as a spacer between the catalytic core and coiled-coil (19P-NL) (Figure 6A). This construct displayed no detectable movement in single-molecule assays with 1 mM ATP (Figure 6B). Remarkably, an external force (3 or 6 pN) from the optical trap caused the “immotile” 19P-NL mutant to step along the microtubule (Figure 6C) with a similar rate to that of WT in the absence of ATP. Load-induced movement in the presence of 1 mM ATP for 19P-NL was ∼4-fold faster (84 ± 6 nm/s) than that under nucleotide-free conditions. Although immotile, 19P-NL has ATPase activity (5-fold lower than WT), which enables its trailing head to transit from a tight (nucleotide-free) to a weak (ADP) binding state. As described above, the ADP state is more susceptible to detachment under load, which most likely accounts for the higher velocities of 19-NL in the presence of ATP. In summary, these results show a kinesin lacking its mechanical element and ATP, can undergo 8 nm unidirectional stepping, if external tension is applied to the motor.

結果 (中文) 1:

我们也观察到固有的不对称力引起的运动，以更快的速度观察同等幅度拉朝向微管正端，负端（图5a）相比。这样的结果是一致的具有较低的解除绑定的力量时测得动蛋白被拉向正端，负端（uemura（植村秀），石绵，2003年）（见讨论）。

接下来，我们测试是否可以诱导AMPPNP（不可水解的ATP类似物）的存在下，这会导致驱动蛋白比核苷酸的分类条件（川口，石绵，2001），更紧密地结合到微管中的运动所施加的力，和ADP诱导弱结合状态。与1毫米AMPPNP，9 PN力诱导踏向正端，而需要更大的力12的pn产生负端部导向的步进（图5b）。 6 PN负荷，从而诱发的踏步核苷酸的条件下，并没有导致加强1：毫米AMPPNP（图S11）。在ADP的存在下，低得多的力〜1的pn足以向正端移动至驱动蛋白（参见实验程序）（图5c）。的移动速度依赖于ADP浓度（图5c，插入），这可能反映动蛋白，微管结合的头花的碱基 - 自由状态的相对时间（耐脱离1的pn负载）与一种弱绑定的ADP状态（见uemura（植村秀），石绵，2003）。再次，更高的负载（2的pn）所需的驱动运动，在ADP的存在下向负端。 uemura（植村秀），石绵（2003）相比，我们发现，较低的力（1-2 PN）是足以让头部支队结合ADP相比，报告的平均解除绑定势力3-4 PN。植村秀和石绵测量的更大的力可能是解释通过使用一个不断移动的陷阱（而不是一个力反馈陷阱），导致迅速增加的负载，测量的较大的力（根据时间常数脱离）。在总结，这些实验揭示了步进所需的力的量是最有可能由微管的后部驱动蛋白头的亲合性。此外，还有一个明确的方向性不对称的支队所有核苷酸的条件下，所需的力是驱动蛋白运动的法线方向拉时，尾随头部支队

接下来我们探讨是否可能取代一种力量诱导构象变化的脖子链接器的拉力。测试这个想法，我们删除基座上的催化核心和附加的19脯氨酸的催化核心（19便士nl）的卷曲螺旋结构（图6a）之间的间隔物作为本机的颈接头序列。此构造在单分子检测显示没有可检测到的运动与1毫米atp的（图6b）。显着，从光陷阱的外力（3或6的pn）引起的“immotile的”19便士-nl的突变体沿微管的步骤（图6c）以类似的速度（重量），在没有三磷酸腺苷。荷载作用下的运动在1毫米ATP的存在下在19便士nl已约快4倍，比在核苷酸的条件下（84±6 nm / s时）。 19P-NL虽然immotile，具有ATP酶活性（重量低于5倍），这使得其尾部头从紧（核苷酸）过境弱（ADP）绑定状态。的ADP状态，如上所述，是在负载下更容易脱离，其中最有可能的占19-nl已在ATP的存在的更高的速度。总之，这些结果表明动蛋白缺乏其机械元件和ATP，可以经过8nm的单向步进，如果外部的张力被施加到电动机。

結果 (中文) 2:

我们还观察到的力引起的运动固有的不对称性，以更快的速度相等的幅度观察拉朝向微管正端和负端，比较（图5A）。这样的结果是一致的与较低的解脱力测量时，驱动蛋白被拉向的正端与负端，相比（2003 Uemura Ishiwata，）（见讨论）。

接下来我们测试是否施加的力可以引起AMPPNP的存在下运动（水解的ATP模拟），导致微管微管结合比核苷酸自由条件更紧密（川口，Ishiwata，2001），和ADP，导致弱结合状态。用1毫米的AMPPNP，9 PN力所需的诱导走向正端，而更高的力量12 PN需要产生负端定向步（图5B）。6 PN负荷，引起步进核苷酸自由的条件下，不会导致步进1毫米的AMPPNP（图11）。在ADP的存在下，对∼1 PN力低得多，足够的走向正端驱动蛋白（见实验程序）（图5C）。运动速度取决于ADP浓度（图5c，插入），这可能反映了束缚在一个核苷酸的游离态花驱动蛋白头部微管的相对时间（耐1个PN负载脱离）与弱结合的ADP状态（参见Uemura Ishiwata，2003）。再一次，较高的负载（2 PN）的需要来驱动朝向负端在ADP的存在下。相反，植村秀，Ishiwata（2003），我们发现，较低的力量（1–2 PN）足以与结合的ADP头脱离，与他们报道的平均解绑定势力3–4 PN相比。更高的力量由Uemura Ishiwata测量是由使用不断移动的陷阱可能解释（而不是一个力反馈的陷阱），导致一个迅速增加的负荷和较大的力的测量（取决于不断的脱离的时间）。在总结，这些实验表明，所需的步进量的力是最有可能的后方驱动蛋白头微管的亲和力测定。此外，有一个明确的方向性的不对称性脱离所有的核苷酸的条件下，用更少的力耙头脱离时拉是驱动蛋白运动所需的

法线方向。接下来我们探讨拉力可能代替诱导的颈部连接的构象变化的力量。为了验证这个想法，我们删除原生颈连接序列，码头上的催化核心和作为催化核心和之间的间隔的螺旋线圈增加19的脯氨酸（19p-nl）（图6a）。这种结构显示没有检测到运动在单分子检测与1毫米ATP（图6b）。值得注意的是，一个外部的力（3或6 PN）从光学陷阱造成“死”19p-nl突变步骤沿微管（图6C）与ATP的没有重量，相似率。荷载引起的运动在1毫米ATP的存在是∼19p-nl 4倍的速度（84±6 nm / s）相比，核苷酸自由的条件下。虽然不能动，19p-nl具有ATP酶活性（5倍低于WT），使从一个狭小的尾头运输（核苷酸免费）到一个弱（ADP）结合状态。如上所述，ADP状态下更容易脱离负载，其中最有可能占较高的速度19-nl在ATP的存在。总之，这些结果表明其机械元件和ATP缺乏驱动蛋白，能经受住8 nm的单向步进，如果外部张力被施加到电动机
。

結果 (中文) 3:

我们还注意到在诱导力运动，以更快的速度为指向的微管加上结束，相同的数量级拉观察到中固有的不对称性与减号 (图 5A) 相比。这一结果是符合较低解除绑定部队时驱动蛋白被拉扯往加上结尾，测量与减号 （植村和石绵，2003年） 相比 （见讨论）.

我们下一步测试是否应用的力可以诱导运动在 AMPPNP （nonhydrolyzable ATP 模拟），这会导致驱动蛋白将更紧密地绑定到在核苷酸免费条件 （川口和石绵，2001年） 比微管和 ADP，诱使弱绑定状态。以 1 毫米 AMPPNP，9 pN 力被需要诱使往加上结尾，步进而 12 pN 的较高部队被要求出示减号结束指示步进 (图 5B)。6 PN 负载，诱导步进核苷酸自由的条件下，并不导致步进与 1 毫米 AMPPNP （图 S11)。下 ADP，∼1 pN 多低的力量，足以将移往加上结尾 （见实验程序） 驱动蛋白 (图 5)。运动速度是依赖 ADP 浓度图 5 C 插入），这可能反映了的微管绑定驱动蛋白头花在核苷酸自由状态 (耐到支队 1 pN 负载） 和微弱地绑定 ADP 状态中的相对时间 (也参见植村和石绵，2003年)。再来一次更高的负载 （2 pN） 需要开车往下 ADP 的减号末端的运动。植村和石绵 （2003 年），我们发现较低的部队 （1-2 pN） 足以允许绑定 ADP，相比其报告的平均解除绑定部队的 3-4 pN 头脱离。他们使用的 （而不是力反馈陷阱），不断移动陷阱，导致迅速增加的负载和更大的力量 （根据支队的时间常数） 的测量可能解释是由植村和石绵测量更强的力量。总之，这些实验揭示的部队所需的步进量是最有可能由微管的后方驱动蛋白头的关联来确定。此外，有清楚的指示不对称在所有核苷酸条件下，以所需的尾随头脱离时拉是在正常的驱动蛋白运动方向较少力量脱离.

我们下一步探讨是否拉力可能代替武力诱导的构象变化的颈部链接器。若要测试这个想法，我们删除了本机颈部链接器序列，码头上催化核心并添加 19 prolines 作为一个催化核心和盘绕-线圈 (19 P-NL) (图 6A) 之间的分隔。此构造在单分子检测与 1 毫米 ATP (图 6B) 中显示没有动静。引人瞩目的是，外力 （3 或 6 pN） 从光学陷阱的 WT 中 ATP 缺乏类似率造成"immotile"19 P-NL 突变体加强沿微管 (图 6)。负荷所致运动下 1 毫米 ATP 为 19 P-NL 是 ∼4 折叠速度更快 (84 ± 6 nm/s) 比，在核苷酸自由的条件下。虽然 immotile，19 P-NL 有 ATPase 活性 (5 倍低于 WT)，这使得它的尾随头向过境从紧 (无核苷酸) 到弱 (ADP) 绑定状态。如上文所述，ADP 状态是到支队在负载下，更容易其中最有可能占 19-NL ATP 存在的较高速度。总之，这些结果显示驱动蛋白缺乏其机械元素和 ATP，可以接受 8 毫微米单向步进，是否外部张力应用于电机.