Immunofluorescence, BrdU labeling a

Immunofluorescence, BrdU labeling and cell counting
After fixation with 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS for 15 minutes at RT, cells were
permeabilized and blocked with blocking solution (1×PBS containing 0.2% Triton X-100
and 3% BSA) for 1 hr. Primary antibodies in blocking solution were then added and
incubated overnight at 4°C, followed by washing and incubation with fluorophore￾conjugated corresponding secondary antibodies. Proliferating cells were labeled by BrdU
(10 μM) for 2 hrs or throughout the culture, as indicated. BrdU-incorporation was detected
as previously described49. Briefly, PFA-fixed cells were treated with 2 M HCl for 30 min at
37°C, rinsed in 0.1 M boric acid for 10 min, and blocked with blocking solution. This was
followed by incubation with primary and secondary antibodies. The following antibodies were used: rabbit anti-NGN2 (Chemicon, 1:500), rabbit or mouse anti-Tuj1 (Covance,
1:20,000), mouse anti-MAP2 (Sigma, 1:750), chicken anti-Tau (AVES, 1:500), mouse anti￾NeuN (Chemicon, 1:500), mouse anti-vGluT1 (UC Davis, 1:100), mouse anti￾synaptotagmin 1 (SYT1, DSHB, 1:200), rabbit anti-GABA (Sigma, 1:2000), rabbit anti￾Sox1 (Cell Signaling, 1:100), rabbit anti-Sox2 (Chemicon, 1:500), rabbit anti-Olig2
(Millipore, 1:500), mouse anti-BrdU (Sigma, 1:2000), mouse anti-HB9 (DSHB, 1:100),
mouse anti-ISL1/2 (DSHB, 1:100), mouse anti-VAChT (DSHB, 1:200), goat anti-ChAT
(Chemicon, 1:200), and Alexa Fluor-conjugated secondary antibodies made in donkey
(Invitrogen, 1:500). Images were obtained with a Carl Zeiss LSM510 Confocal Microscope
or an Olympus BX51 Microscope equipped with StereoInvestigator software (MBF
Bioscience). After counting the total number of Tuj1+ cells within the entire well of a 24- or
48-well plate in triplicate, conversion efficiency was calculated by normalizing to the
number of plated cells or to the number of surviving GFP+ cells.

結果 (中文) 1:

免疫荧光法，BrdU 标记和细胞计数后在室温下 15 分钟 4%多聚甲醛 (PFA) 在 PBS 中固定，细胞通透性的改变和阻止与阻塞解决方案 (1 × PBS 含 0.2%Triton X-100和 3 %bsa） 为 1 小时小学抗体封闭液中的，然后添加和一夜之间孵化在 4 ° C，其次是洗涤和孵化与荧光共轭相应二级抗体。由 BrdU 标记增殖细胞，(10 μ M) 为 2 小时或整个文化，如。BrdU 纳入被检测到正如先前 described49。简单地说，PFA 固定细胞患者 2 M HCl 为 30 分钟37 ° C，在 0.1 M 硼酸为 10 分钟，冲洗和用封闭液堵塞。这是其次是与中小学抗体孵育。使用了以下抗体︰ 兔抗 NGN2 （Chemicon，1: 500）、 兔或鼠标反 Tuj1 （科，1:20，000)，鼠标反 MAP2 （西格玛，为 1: 750）、 鸡反头 （鸟类，1: 500），小鼠抗著 (Chemicon，1: 500)，小鼠抗-vGluT1 （加州大学戴维斯分校，1: 100），鼠标抗突触 1 (SYT1，DSHB，1: 200)，兔抗 GABA （西格玛，航拍），兔抗 Sox1 （细胞信号转导，1: 100），兔抗-Sox2 (Chemicon，1: 500)，兔抗 Olig2（微孔，1: 500），小鼠抗 BrdU （西格玛，航拍），小鼠抗-HB9 (1: 100，DSHB)，鼠标反 ISL1/2 (1: 100，DSHB)，小鼠抗-VAChT (1: 200，DSHB)，山羊抗聊天(Chemicon，1: 200)，和 Alexa 氟共轭二次抗体在驴(1: 500，Invitrogen)。卡尔 · 蔡司 LSM510 共焦显微镜，得到图像或配备 StereoInvestigator 软件 (MBF 奥林巴斯 BX51 显微镜生物科学）。后计数的 Tuj1 + 细胞内整口井 24-总数或一式三份，转换效率 48 孔板计算通过对规范编号的镀细胞或数量的生存 GFP + 细胞。

結果 (中文) 2:

免疫荧光法，BrdU标记和细胞计数
用4％多聚甲醛（PFA）的PBS在RT15分钟固定后，将细胞
透化，并用封闭液（1×PBS含有0.2％的Triton X-100
和3％BSA）中1小时。然后在封闭溶液初级抗体加入并
在4℃下用荧光团???偶联相应的二抗温育过夜，通过洗涤和孵化遵循。增殖细胞被BrdU标记
（10μM）处理2小时或整个培养，所指示的。BrdU的掺入检测
如以前described49。简要地说，PFA固定的细胞用2M HCl处理，在30分钟
37℃，在0.1M硼酸冲洗10分钟，并用封闭溶液。这是
随后用第一和第二抗体孵育。以下抗体：兔抗NGN2（Chemicon公司，1：500），兔或小鼠抗TUJ1（Covance公司，
1：20,000），小鼠抗MAP2（Sigma公司，1：750），鸡抗头（AVES ，1：500），鼠抗???的NeuN（Chemicon公司，1：500），鼠抗vGluT1（加州大学戴维斯分校，1：100），鼠抗???突触1（SYT1，DSHB，1：200），兔抗GABA（Sigma公司，1：2000），兔抗??? SOX1（Cell Signaling公司，1：100），兔抗Sox2的（Chemicon公司，1：500），兔抗Olig2的
（Millipore公司，1：500） ，小鼠抗BrdU（Sigma公司，1：2000），小鼠抗HB9（DSHB，1：100），
鼠抗ISL1 / 2（DSHB，1：100），鼠抗中VAChT（DSHB，1：200）山羊抗胆碱
（Chemicon公司，1：200），和在驴制成的Alexa Fluor缀合的二抗
（Invitrogen公司，1：500）。有Carl Zeiss LSM510共聚焦显微镜获得的图像
或奥林巴斯BX51显微镜配备StereoInvestigator软件（MBF
Bioscience公司）。24-或整个井内计数TUJ1 +细胞的总数后
，一式三份的48孔平板，转换效率通过正常化于计算
铺的细胞的数目或存活的GFP +细胞的数目。

結果 (中文) 3:

免疫荧光，BrdU标记和细胞计数用4%的多聚甲醛固定后（PFA）在PBS 15分钟，在室温下，细胞透性和封闭液封闭（1×PBS含有0.2%的Triton X-1003%牛血清白蛋白）1小时。在阻断溶液中的初级抗体，然后添加和培养4°C一夜之间，其次是洗衣和荧光￾孵化共轭相应抗体。增殖细胞BrdU标记的（10μm）为2小时或整个文化，如所示。检测到BrdU掺入如前described49。简而言之，PFA固定细胞用2 M HCl 30 min37°C，在0.1 m的硼酸冲洗10分钟，用封闭液封闭。这是其次是原发性和继发性抗体的培养。使用下列抗体：兔anti-ngn2（Chemicon公司，1:500），兔子或老鼠anti-tuj1（Covance，1:20000），小鼠标记（Sigma，1:750），鸡抗Tau（鸟类、1:500）、鼠抗￾NeuN（Chemicon公司，1:500），鼠标anti-vglut1（UC戴维斯，1:100）、鼠抗￾突触结合蛋白1（syt1，dshb，1:200），兔抗GABA（Sigma，1:2000），兔抗￾基因（细胞信号转导，1:100），兔anti-sox2（Chemicon公司，1:500），兔抗-OLIG2（微孔，1:500），小鼠抗BrdU（∑，1:2000），鼠标anti-hb9（dshb，1:100），鼠标anti-isl1 / 2（DSHB，1:100），小鼠抗VAChT（dshb，1:200），羊抗聊天（确定，1:200），和Alexa Fluor标记的二次抗体在驴（Invitrogen，1:500）。用Carl Zeiss lsm510共焦显微镜图像或Olympus BX51显微镜配备stereoinvestigator软件（MBF生物科学）。经过清点的Tuj1 +细胞总数在24全井或48孔板一式三份，通过规范的计算转换效率镀的细胞的数量或存活的绿色荧光蛋白+细胞的数量。