Optical Trapping AssaysOptical trap

Optical Trapping Assays

Optical trap measurements of eGFP-tagged WT, 13P, 19P, and 14GS constructs were performed with a custom-built optical trapping microscope (Gennerich et al., 2007). Briefly, 0.92 μm diameter latex beads were crosslinked to anti-GFP antibodies and incubated with the GFP-tagged motors. The motor-bead ratio was adjusted so that 30% of the beads displayed movement. Under these conditions, there is >99% probability that bead movements were due to single kinesin molecules (Svoboda and Block, 1994). Spring constants of 0.04–0.06 pN/nm were used for WT to allow a maximal bead-trap separation of 100–150 nm. For the neck mutants, spring constants of 0.025–0.035 pN/nm were used.

Stall force measurements were performed with a fixed position optical trap. Kinesin stepping under constant loads was analyzed by using the force-feedback mode of the optical trap. Velocities were obtained by line fits to the displacement traces of the beads moving under constant load. Measurements in the absence of ATP were performed by adding 20 U/ml apyrase to deplete residual ATP and ADP (which would in any event be

結果 (中文) 1:

光学捕获检测

光阱测量EGFP标记的重量，13P，19P，14gs结构进行一个定制的光学捕获显微镜（gennerich等，2007）。简单地说，直径为0.92微米的乳胶珠，交联的抗GFP融合抗体，并温育与绿色荧光蛋白标记的电机。电机珠比的调整，使30％的有孔玻璃珠显示的运动。在这些条件下，有> 99％的可能性，胎圈变动是由于单个驱动蛋白分子（自由报，1994年，块）。 0.04-0.06 PN /纳米弹簧常数被用于重量为100-150 nm允许的最大陷阱珠分离。颈部突变，弹簧常数为0.025-0.035 PN /纳米
失速一个固定的位置进行光阱力测量。恒载动蛋白步进进行了分析，通过使用力反馈模式的光学陷阱。线拟合位移恒定负载下移动的有孔玻璃珠的痕迹速度通过以下方式获得。atp的测量的情况下进行，加入20单位/毫升的三磷酸腺苷双磷酸酶，消耗残留的ATP和ADP（在任何情况下，后<3纳米动蛋白的单分子检测的最终稀释度）。珠势必轴丝（由布朗噪声减少）没有表现出运动时的光陷阱被关闭，确认ATP耗竭。在ATP缺乏纵向向前和向后的力量施加到电机通过力反馈控制的陷阱（补充资料）。完成后，测量的力引起的驱动蛋白在ATP的情况下，步进电机珠1毫米atp的溶液中，流入到室中，通过驱动驱动蛋白微管正端的胎圈运动确定极性的轴丝。拉实验在不同浓度的ADP进行添加2u/ml己糖激酶保证运动atp的剩余在溶液中不诱导。

使用自动步查找算法的kerssemakers等进行分析的步骤和停留时间两个光陷阱和单分子荧光数据。 （2006年）。



确认

感谢AP卡特和n。张他们的帮助与蛋白质纯化及克隆和j。 kerssemakers和m。 dogterom提供他们发现算法的步骤。这项工作已经得到了简棺材孩子纪念基金（AY和AG），宝来惠康基金（AY），德国研究基金会（GE 1609/1 [公司]），霍华德休斯医学研究所。

結果 (中文) 2:

光学捕获检测

光阱测量蛋白标记的重量，磷，和14gs 19p，构建一个定制的光学捕获显微镜进行（gennerich等人。，2007）。简要地说，0.92μ米直径的乳胶珠被交联的抗GFP抗体孵育与GFP标记的汽车。电机珠率调整使珠30%显示运动。在这些条件下，有99%的概率，珠>动作是由于单驱动蛋白分子（斯沃博达块，1994）。0.04–0.06 PN /纳米弹簧常数被用于重量允许的100–最大150纳米珠陷阱分离。对颈部的突变体，使用了0.025–0.035 PN / nm的弹簧常数。

失速力进行测量与一个固定的位置的光学陷阱。驱动蛋白步进恒载荷下的光阱力反馈模式分析。速度得到了线的珠子适合移动恒定荷载下的位移的痕迹。在没有ATP的测量是通过添加20 U／ml apyrase消耗剩余的ATP和ADP执行（这将在任何情况下均应＜3 nm的单分子检测的驱动蛋白的最终稀释后）。珠，绑定到的轴丝（由布朗噪声降低测定）没有表现出运动时，光陷阱被关闭，确认ATP耗竭。在没有ATP的纵向向前和向后的力通过控制圈闭的力反馈应用于电机（补充资料）。在完成测量力引起的驱动蛋白踏在没有ATP，含1毫米ATP被空运到室确定轴丝的微管正端通过驱动蛋白驱动极性定向运动珠液珠。拉实验在不同浓度的ADP加2U／ml己糖激酶确保运动不是在溶液中剩余的ATP诱导

执行。两个光学陷阱和单分子荧光数据的步骤和停留时间的分析是使用自动步总等人发现算法进行。（2006）。





致谢作者感谢美联社卡特和N张他们的帮助与蛋白质的纯化和克隆和总供给和M. dogterom步搜索算法。这项工作一直由Jane Coffin儿童纪念基金（依原和AG），Burroughs Wellcome基金（依原），德国研究基金会（GE 1609 / 1 [公司]），和霍华德休斯医学研究所
。

結果 (中文) 3:

光学陷印化验

光学陷阱测量的绿色荧光蛋白标记的 WT、 13 P、 19 P 和 14GS 构造进行用定制光阱显微镜 （根内里希 et，2007年)。简单地说，0.92 μ m 直径乳胶珠反-绿色荧光蛋白抗体交联和孵化与绿色荧光蛋白标记的电动机。电机-珠的比率作了调整，以便显示 30%的珠运动。在这些条件下，有 > 珠的运动是由于单一驱动蛋白分子 （斯沃博达和块，1994年） 的概率 99%。弹簧常数的 0.04–0.06 pN/nm 被用于 WT 允许的 100–150 nm 的最大珠陷阱分离。为脖子变种人，使用了弹簧常数的 0.025–0.035 pN/nm.

档力的测量执行与一个固定的位置光陷阱。在恒定负载下步进驱动蛋白是通过使用光阱力反馈模式进行分析。由位移痕迹的移动在恒定负载下的珠线拟合获得了速度。三磷酸腺苷在没有测量由添加 20 U/ml 苷以耗尽剩余 ATP 和 ADP (这在任何情况下将 < 3 毫微米的驱动蛋白单分子检测中的最后稀释后)。光学陷阱被关闭，确认 ATP 耗尽时，绑定到 axoneme （由布朗噪声的减少） 的珠未显示运动。纵向的向前和向后部队在 ATP 缺乏适用于通过力反馈控制陷阱 (补充数据) 电动机。在完成的诱导力驱动蛋白步进三磷酸腺苷，缺乏在测量后电机-珠解决方案，其中包含 1 毫米 ATP 是飞进会议厅，确定通过驱动蛋白驱动微管加上结束指示珠运动 axoneme 的极性。拉实验中各种浓度的 ADP 均由 2U/ml 己糖激酶，以确保该运动不诱导残余 ATP 在解决方案中添加.

使用的自动化的步骤查找算法的 Kerssemakers 等人 （2006 年） 进行分析的步骤与光学陷阱和单分子荧光数据驻留时间.


确认

作者感谢美联社卡特和 N.张他们的帮助，蛋白质纯化和克隆和 J.Kerssemakers 和 M.Dogterom 供应他们查找算法的步骤。这项工作得到了简的棺材查尔兹纪念基金 (A.Y.和检察总长)、 宝来惠康基金 (A.Y.)、 德国研究基金会 (GE 1609/1 [检察总长]） 和霍华德 · 休斯医学研究所.