To identify the sequence of the hat

To identify the sequence of the hatching enzyme in A. callidryas, we created a BLAST database of the assembled transcriptome of hatching-competent,5-day-old A. callidryas embryos (data available upon request). We searched the database using the Xenopus laevis hatching enzyme transcript (‘XHE’ or ‘UVS.2’;GenBank D89632.1) and found one homologous contig. We then used gene-specific primers (forward primer, 5′-ACAACATGGGCGAGAAGATTTA-3′;reverse primer, 5′-TGAAGTTTCCTTGTGGTGTGATA-3′) to amplify the transcript from reversetranscribed complementary DNA from hatchingcompetent A.callidryas embryos. The product was cloned into pGEM T Easy (Promega) and transformed into XL-1 Escherichia coli for amplification; plasmids were purified for sequencing and probe synthesis using Qiagen miniprep and maxiprep kits. The A.callidryas hatching enzyme (‘AcHE’, GenBank accession number KY924327) sequence and amino acid sequence alignment are reported by Cohen et al.(2018). After linearization with SacII, the plasmid was used to synthesize a digoxigenin-labelled anti-senseRNA probe using the SP6 RNA polymerase. Our probe encompassed 1124 bp of sequence complementary to the target mRNA. Our probe sequence covered both a zinc metalloprotease active site and one of the CUB domain repeats common to amphibian hatching enzymes (Nagasawa et al., 2016). Nucleotide BLAST analysis on the probe sequence returned only the X. laevis hatching enzyme and no other protein or enzyme. In addition, phylogenetic analysis showed that the A. callidryas hatching enzyme transcript was more similar to hatching enzymes from frogs and fishes than it was to any other proteins from the astacin-like metalloprotease family M12A (Cohenet al., 2018).

結果 (繁體中文) 1:

為了鑑定A. callidryas孵化酶的序列，我們創建了孵化能力的，5天齡A. callidryas胚胎（可根據要求的數據）的組裝轉錄的BLAST數據庫。我們檢索使用非洲爪蟾孵化酶成績單數據庫（'XHE'或'UVS.2';基因D89632.1），發現一個同源重疊群。然後，我們使用基因特異性引物（正向引物，5'-ACAACATGGGCGAGAAGATTTA-3';反向引物，5'-TGAAGTTTCCTTGTGGTGTGATA-3'）擴增從hatchingcompetent A.callidryas胚胎reversetranscribed互補的DNA轉錄。將產物克隆到pGEM T Easy中（Promega）中，並轉化到XL-1的大腸桿菌用於擴增; 質粒用於使用Qiagen小量製備和大量製備試劑盒測序和探針合成純化。所述A.callidryas孵化酶（'ACHE'，GenBank登錄號KY924327）序列和氨基酸序列比對由Cohen等人的報導。（2018）。用SacII線性化後，將質粒用於合成地高辛標記的反義
使用SP6 RNA聚合酶的RNA探針。我們的探頭包含序列互補的1124個鹼基對的靶mRNA。我們的探針序列覆蓋的兩個鋅金屬蛋白酶的活性位點和CUB結構域重複常見的一種兩棲動物孵化酶（Nagasawa等人，2016）。上返回的探針序列的核苷酸BLAST分析只非洲爪蟾孵化酶並沒有其他的蛋白質或酶。此外，系統發育分析表明，A. callidryas孵化酶轉錄物更類似於從青蛙和魚類孵化酶比它從蝦紅素樣金屬蛋白酶家族M12A任何其他蛋白（科恩
等人，2018）。

結果 (繁體中文) 2:

為了識別A.callidryas中孵化酶的序列，我們創建了一個BLAST資料庫，該資料庫是孵化能力為5天的A.卡利德里亞胚胎的聚集轉錄組（可應要求提供的資料）。我們使用 Xenopus laevis 孵化酶轉錄本（'XHE'或"UVS.2"）搜索資料庫;GenBank D89632.1），併發現了一個同源鄰接。然後，我們使用基因特異性引物（前引物，5°-ACAACATGGGAGAAATTA-3_;反向引物，5_TGAATTTTTTTGTGGGATA-3+）從孵化能力A.callidryas胚胎的反向轉錄互補DNA中擴增轉錄的轉錄補充DNA。該產品被克隆成pGEM T Easy（Promega），並轉化為XL-1大腸桿菌進行擴增;使用Qiagen微型和maxiprep試劑盒對質粒進行純化，用於測序和探針合成。Cohen等人（2018年）報告了A.callidryas孵化酶（"AcHE"，GenBank加入號KY924327）序列和氨基酸序列對齊。使用SacII線性化後，質粒用於合成二角基因標記的抗感
使用SP6RNA聚合酶的RNA探針。我們的探針包括1124 bp序列補充目標mRNA。我們的探針序列涵蓋了鋅金屬蛋白酶活性位點和兩栖孵化酶常見的CUB域重複（Nagasawa等人，2016年）。對探針序列的核苷酸BLAST分析只返回X.laevis孵化酶，沒有其他蛋白質或酶。此外，植物遺傳學分析表明，A. 卡利多亞斯孵化酶轉錄比從阿他汀類金屬洛普托Ease家族M12A（科恩科恩）孵化酶更類似于孵化酶。
等人，2018年）。

結果 (繁體中文) 3:

為了確定愈傷組織中孵化酶的序列，我們建立了一個5日齡愈傷組織孵化胚胎的組裝轉錄組的BLAST資料庫（可根據要求提供數據）。我們使用非洲爪蟾孵化酶轉錄本（XHE或UVS.2；GenBank D89632.1）蒐索了資料庫，發現了一個同源的contig。然後我們用基因特异性引子（正向引子，5′-acatggggagagagatta-3′；反向引子，5′-tgagtttcgtggtgata-3′）擴增來自hatchingcompetent A.callidryas胚胎的反向轉移互補DNA的轉錄本。將產物尅隆到pGEM-T-Easy（Promega）中，轉化到XL-1大腸桿菌中進行擴增，純化質粒，用Qiagen-miniprep試劑盒和maxiprep試劑盒進行測序和探針合成。Cohen等人（2018）報導了愈傷組織孵化酶（'AcHE'，GenBank登錄號KY924327）序列和胺基酸序列比對。與SacII線性化後，用該質粒合成地高辛標記的反義蛋白
使用SP6 RNA聚合酶的RNA探針。我們的探針包含1124bp與靶mRNA互補的序列。我們的探針序列覆蓋鋅金屬蛋白酶活性位點和兩棲動物孵化酶常見的幼體結構域重複序列（長崎等人，2016）。對探針序列的核苷酸爆炸分析只返回了金絲猴孵化酶，沒有其他蛋白質或酶。此外，系統發育分析表明，與蝦青素類金屬蛋白酶家族M12A（Cohen）的任何其他蛋白質相比，愈傷組織孵化酶轉錄本更類似於青蛙和魚類的孵化酶
等，2018年）。